Expressão das óxido nítrico sintetases na vasculopatia coronariana do transplante cardíaco.

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Viaro F & Évora PRB - Rev Bras Cir
Cardiovasc 2000; 15 (1): 55-65.
Rev Bras Cir Cardiovasc 2000;
15(1): 55-65.
Expressão das óxido nítrico sintetases
na vasculopatia coronariana do
transplante cardíaco
Trabalho realizado na Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo. Ribeirão Preto, SP, Brasil.
* Da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da USP.
Recebido para publicação em outubro de 1999.
Endereço para correspondência: Paulo Roberto B. Évora. Rua Rui Brabosa, 367, Apto 7. Ribeirão Preto, SP, Brasil. CEP 14015-120. Tel: (016) 636-4149.
Fax: (016) 610-9890. e-mail: prbevora@keynet.com.br
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cardíaco. Rev Bras Cir Cardiovasc 2000; 15 (1): 55-65.
RESUMO: A maior complicação que pode limitar a evolução a longo prazo de um transplante cardíaco
é o desenvolvimento de doença arterial coronariana. Esta forma de doença coronariana é distinta da doença
coronariana aterosclerótica de pacientes não submetidos a transplante cardíaco. Evidências atuais, obtidas
mediante a ecografia intravascular, demonstraram que a ocorrência de uma disfunção endotelial precoce,
principalmente mediada pela expressão da isoforma induzível da óxido nítrico sintetase (iNOS) e associa-se
com desenvolvimento de aterosclerose no aloenxerto durante o primeiro ano após o transplante. Esta revisão
foi elaborada começando pelos conceitos básicos (descrição da enzima NOS e suas isoformas conhecidas;
breve comparação entre elas), revisando-se, na seqüência, a disfunção endotelial coronariana pós-transplante
cardíaco do ponto de vista específico da função enzimática da NOS. No transplante cardíaco a iNOS promove
rejeição aguda, mas previne a crônica. A relação entre estes efeitos completamente opostos permanece
desconhecida, sabendo-se que são mecanismos diferentes dependentes do tempo.
DESCRITORES: Síntese de óxido nítrico, metabolismo. Endotélio vascular, enzimologia. Transplante do
coração, fisiologia. Rejeição de enxerto, enzimologia.
Fernanda VIARO & Paulo Roberto B. ÉVORA*
INTRODUÇÃO
A maior complicação que pode limitar a evolução
a longo prazo de um transplante cardíaco é o desenvolvimento
de doença arterial coronariana (DAC) (1).
Esta forma de doença coronariana é distinta da doença
coronariana aterosclerótica de pacientes não submetidos
a transplante cardíaco. A doença coronariana
em corações transplantados parece começar nos
vasos distais, progredindo proximalmente. É encontrada
raramente próxima a bifurcações dos vasos
epicárdicos maiores e, portanto, não é fácil de ser
tratada por angioplastia percutânea ou, mesmo, por
revascularização cirúrgica do miocárdio. Esta forma
de aterosclerose coronariana é clinicamente silente,
por causa do estado denervado do coração transplantado,
apresentando-se como disfunção ventricular
esquerda ou arritmia na ausência de angina do peito.
Uma coronariografia rotineira anual é, em geral, necessária
para o seguimento desta complicação.
Histologicamente, estes vasos têm um estreitamento
fibroso concêntrico sem o padrão da clássica placa
aterosclerótica excêntrica. A maioria dos pacientes
transplantados mostram evidências de DAC dentro
de três anos. Embora a causa desta situação não
seja clara, ela representa, provavelmente, uma rejeição
vascular crônica no meio do ambiente aterogênico
(hipertensão, hipercolesterolemia, etc.). O tratamento
não previne o desenvolvimento desta complicação,
que é a maior causa para a consideração de retransplante
nos primeiros seis meses do pós-operatório.
Evidências atuais, obtidas mediante a ecografia
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intravascular, demonstraram que a ocorrência de uma
disfunção endotelial precoce, principalmente mediada
pela expressão da isoforma induzível da óxido
nítrico sintetase (iNOS) e associa-se com desenvolvimento
de aterosclerose no aloenxerto durante o
primeiro ano após o transplante (2).
Um trabalho ítalo-americano examinou 39
aloenxertos cardíacos colocados durante mais de 2
meses e 37 enxertos durante 2 meses, realizando
uma série de observações relacionadas com a
vasculopatia pós-transplante: 1) A vasculopatia do
aloenxerto afeta a todas as camadas das artérias
coronárias epicárdicas e, geralmente, as artérias
coronárias intramurais da metade externa da parede
ventricular esquerda. 2) A lesão da íntima resultante
é relativamente uniforme, e constante principalmente
em tecido fibroso celular e acelular; é difusa e
afeta a todos os segmentos das artérias coronárias
epicárdicas maiores e menores. 3) O grau de estreitamento
luminal resultante é similar na maioria dos
segmentos coronários de 5mm, o que torna arriscado
prever com confiança o grau de estreitamento
luminal mediante uma angiografia coronária. 4) A
extensa fibrose adventícia e a intensa infiltração de
tecido fibroso subepicárdico, provavelmente, inibem
a dilatação e a remodelação das artérias coronárias
epicárdicas e, sem dúvida, as pode comprimir. 5) O
estreitamento luminal das artérias coronárias epicárdicas
após o transplante pode ser conseqüência
tanto das lesões intraluminais como da compressão
exterior do tecido fibroso circundante. 6) Se observa
com freqüência trombo intraluminal e intralesão,
assim como canais multiluminais nas placas coronárias,
o que sugere que a organização dos trombos
desempenha certo papel na progressão da CAD
epicárdica pós-transplante. 7) As lesões coronárias
que se formavam após o transplante cardíaco têm
uma composição morfológica muito diferente das
que aparecem na aterosclerose natural (sem transplante).
8) Os infiltrados inflamatórios celulares são
freqüentemente extensos nos tecidos subepicárdicos,
e os infiltrados nesta área podem ser extensos,
inclusive quando os infiltrados inflamatórios miocárdicos
intersticiais são mínimos ou ausentes (3).
O produto da óxido nítrico (NO) sintetase é o
mais potente vasodilatador endógeno conhecido. O
NO além de ser um potente vasodilatador e inibidor
da adesão e agregação plaquetárias, reduz a aderência
de leucócitos ao endotélio vascular, e, também
suprime a proliferação de células da musculatura
lisa vascular por inibição de fatores de crescimento
(4). A importância fisiológica deste fator
endotelial tem sido demonstrada em animais e
humanos. Administração de inibidores da NOS eleva
a pressão sangüínea devido a um aumento na
resistência vascular sistêmica (5, 6). Inúmeras anormalidades
fisiopatológicas estão associadas à síntese
reduzida e/ou aumento da degradação do NO
vascular. Estas incluem, entre outras, a hipercolesterolemia,
o diabete melito, a hipertensão arterial
e o tabagismo (4). Portanto, o conhecimento
das NO sintetases (NOS), a enzima responsável
pela produção do NO, é de extrema importância
científica, não só para o entendimento de novos
mecanismos fisiopatológicos, mas, também, por ser
um alvo para a descoberta de novas intervenções
terapêuticas, incluindo a DAC pós-transplante (7).
O propósito deste texto é o de revisar o papel
das NOS nos mecanismos fisiológico e fisiopatológico
do sistema cardiovascular. O texto inclui uma síntese
dos conceitos básicos (descrição da enzima
NOS e suas isoformas conhecidas, além de uma
breve comparação entre elas), revisando-se, na
seqüência, a disfunção endotelial coronariana póstransplante
cardíaco do ponto de vista específico da
função enzimática da NOS e, finalizando, com comentários
adicionais pertinentes ao assunto.
CONCEITOS BÁSICOS
As óxido nítrico sintetases (NOSs), do ponto de
vista bioquímico, são uma família de enzimas complexas
que catalisam a oxidação da L-arginina para
formar óxido nítrico e L-citrulina. Elas são melhor
caracterizadas como citocromo hemeproteínas semelhantes
ao citocromo P-450 que dependem de
cofatores como: oxigênio molecular, NADPH, flavinas
e tetrahidrobiopterin. As três formas humanas de
NOS identificadas até agora, ecNOS (constitutiva
endotelial ), nNOS (neuronal) e iNOS (induzida), são
encontradas nos cromossomos humanos 7, 12 e 17,
respectivamente (8), assim foram nomeadas com
base nos tecidos nos quais foram primeiro clonadas
e caracterizadas (4).
Óxido nítrico sintetase constitutiva ou endotelial
(ecNOS) - O papel do NO na regulação do
tônus vascular e da função plaquetária é atribuído
à atividade da forma constitutiva endotelial da NOS.
Inativação da ecNOS limita a contribuição do NO na
homeostase dos vasos e resulta num aumento do
tônus vascular e da adesão e agregação plaquetárias.
A via de transdução de sinal que leva à ativação da
ecNOS, no seu curso completo, começa com a
estimulação de um receptor de membrana, que ativa
uma G-proteína acoplada à fosfolipase C. Esta
enzima regula a via fosfatidilinositol gerando
inositoltrifosfato (IP3) a partir de fosfatidilinositol 4,5-
bifosfato (PIP2) e diacilglicerol (DAG). O IP3 media
a liberação de cálcio do retículo endoplasmático e
o DAG media a entrada de cálcio extracelular. A
elevação na concentração do cálcio intracelular leva
à formação do complexo cálcio-calmodulina, que
ativa a ecNOS, resultando na produção de NO. Essa
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cascata de eventos pode ser desencadeada por duas
classes de agonistas: os dependentes ou os independentes
de receptores de membrana. Agonistas
dependentes de receptores como a acetilcolina, a
adenosina difosfato (ADP), a serotonina, a norepinefrina
e a histamina, ativam a via de transdução
de sinal, pela ligação com o receptor de superfície
celular específico (via completa). Agonistas independentes
de receptores, atuam estimulando, seletivamente,
vários componentes na via de transdução
de sinal, levando à ativação da ecNOS. O fluoreto
de sódio ativa a G-proteína, fosfolipase C ativa a via
fosfatidilinositol, e o ionóforo do cálcio estimula a
liberação de Ca++ do retículo endoplasmático (9) e
são, portanto, agonistas independentes de receptores.
Portanto, a atividade da ecNOS é regulada pela
concentração de cálcio livre intracelular e pelo complexo
Ca++-calmodulina (10) (Figura 1).
A ecNOS é uma proteína expressa de maneira
constitucional associada predominantemente à fração
subcelular, sugerindo que a enzima nativa é
uma proteína componente da membrana. Recentes
análises detalhadas da associação da ecNOS com
a membrana celular mostraram que esta enzima
está localizada no Complexo de Golgi, bem como
em estruturas específicas na membrana identificadas
como cavéolas. A associação da ecNOS com uma
região da membrana plasmática, na qual estão
concentradas várias chaves dos complexos de
transdução de sinal (como G-proteínas), provavelmente
tem profunda repercussão na atividade
enzimática, bem como, na sua acessibilidade aos
processos intracelulares da via de liberação do NO,
incluindo processos não associados ao aumento do
cálcio intracelular (11).
Óxido nítrico sintetase neuronal nNOS - Esta
isoforma está presente nas células neuronais centrais
e periféricas, e, certamente em células epiteliais.
Sua atividade também é regulada por Ca++ e
calmodulina. Suas funções incluem regulação duradoura
da transmissão sináptica no sistema nervoso
central, regulação central da pressão sangüínea,
relaxamento do músculo liso e vasodilatação via
nervos nitrérgicos periféricos. Tem sido envolvida
também na morte de neurônios no acidente vascular
cerebral (12).
Óxido nítrico sintetase induzível (iNOS) - A
expressão desta enzima é manifestada em uma
multidão de células diferentes, incluindo macrófagos,
células endoteliais, células da musculatura lisa
vascular e miócitos cardíacos, depois de estimulação
com lipopolissacárides (LPS), citoquinas (como IL-
1b, TFN-a, IFN-g, IL-6) e outros. Por estas características
tem importante papel em atividades antimicrobianas,
antiparasitárias e antineoplásicas (13-15).
Esta isoforma não é regulada pelo cálcio; ela produz
grande quantidade de NO que tem efeito citostático
nas células alvo parasitadas pela inibição de enzimas
férricas e causando fragmentação do DNA. A indução
da iNOS está envolvida na patofisiologia das doenças
auto-imune e no choque séptico (12).
Devido a dificuldade encontrada pelos autores
desta revisão, em relação às diferentes nomenclaturas
encontradas das isoformas das NOSs, resolveu-
se fazer uma tabela com as possíveis nomenclaturas
dadas a cada isoforma, a fim de facilitar o
entendimento e esclarecimento dos leitores do tema
aqui apresentado (Tabela 1).
Métodos Para o Estudo da Atividade da NOS
Metodologia laboratorial não é a maior motivação
desta revisão, mas o NO é gerado a partir da
L-citrulina pela ação da NO sintetase, uma enzima
codificada por três diferentes genes, e está envolvido
em um crescente número de fenômenos. Assim,
um breve comentário sobre metodologia pode-
Acetilcolina, ADP,
Serotonina, Histamina
Norepinefrina
Fluoreto
de Sódio
Cálcio
Ionóforo
L-ARGININA
ÓXIDO
NÍTRICO
CALMODULINA
Retículo
endoplasmático
PIP2 IP3 Ca++
citoplasma
Ca++
Ca++
membrana DAG
Fig. 1 - Via de liberação do óxido nítrico (NO); PIP2 = fosfatidilinositol
4,5-bifosfato; IP3 = inositoltrifosfato; ecNOS = óxido nítrico
sintetase endotelial constitutiva.
TABELA 1
NOMENCLATURA DA ÓXIDO NÍTRICO
SINTETASES (NOSs)
ENZIMAS NOMENCLATURAS
NOS endotelial eNOS, ecNOS, cNOS, NOS III ou NOS3
NOS neuronal bNOS(brain), NOS I ou NOS1
NOS induzida iNOS, NOS II ou NOS2
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rá ser interessante dentro do texto. Este envolvimento
pode ser documentado por: a) métodos indiretos
usando espectrofotometria e métodos eletromecânicos,
e; b) métodos indiretos por detecção dos
efeitos do NO, incluindo a localização da NOS por
imunoquímica ou hibridização in situ do mRNA,
ensaios biológicos, inibição da atividade da NOS,
atividade de hemeproteínas, produção de nitrato/
nitrito, L-citrulina, GMPc. Uma avaliação cuidadosa
das potenciais armadilhas associadas a estes métodos
indiretos antes das suas utilizações é importante
para evitar erros de interpretação (16).
O conhecimento dos inibidores específicos das
NOSs é de fundamental importância para ensaios
farmacológicos experimentais e terapêuticos.
Inibidores inespecíficos - São aqueles que inibem
tanto a ecNOS como, também, a iNOS. Sendo
derivados metilados e nítricos da L-arginina, atuam
por competição (17), os mais conhecidos são o LNMMA,
o L-NAME e o L-NOARG. Como outro exemplo,
pode-se mencionar a dimetilarginina assimétrica
(asymmetric dimethylarginine - ADMA) que é um inibidor
endógeno circulante da NOS. Estudos demonstraram
que o nível plasmático de ADMA está positivamente
relacionado com fatores de risco para aterosclerose,
sugerindo-se que este antagonista endógeno da NOS
possa ser um marcador de aterosclerose (18 ).
Inibidores específicos - Inibem especificamente
a isoforma iNOS; são eles os glicocorticóides (como
a dexametasona), a aminoguanidina, a L-canavanina,
a N6-(1-imioetil)lisina(L-NIL) e a 2,4-diamino 6-hidróxipirimidina
(17) (Figura 2).
Algumas comparações entre as atividades das
diferentes isoformas são dignas de apresentação
dentro da proposição da discussão dos conceitos
básicos. Como já foi dito, a ecNOS é uma enzima
que tem sua localização associada à membrana,
enquanto que as formas iNOS e nNOS são amplamente
citosólicas (18). Uma outra diferença entre as
isoformas da NOS é em relação à quantidade e
labilidade da molécula de NO produzida. A molécula
de NO é sintetizada por um curto período de tempo
(segundos à minutos) quando decorrente da ativação
enzimática da ecNOS ou nNOS. Em contraste,
a iNOS é expressada só depois da ativação celular
e então produz NO por, relativamente, um longo
período de tempo (horas a dias) (19).
Distribuição Anatômica da NOS no Coração Normal
A maior parte da atividade da ecNOS no coração
está presente no endotélio ao longo da extensa
rede de artérias, veias e capilares dentro do
miocárdio. Esta isoforma endotelial também existe
na camada endocárdica das cavidades cardíacas. A
nNOS parece muito menos proeminente, embora a
exata quantidade desta isoforma seja incerta no
coração. Embora a iNOS não exista no coração
normal, macrófagos associados a processos de
remodelamento após várias formas de lesões cardíacas
contêm esta isoforma. Para todas as NOS,
entretanto, variações entre espécies animais e variabilidade
entre modelos experimentais enfatizam a
importância de estudos relacionados entre estrutura
e função (20).
Funções Autócrinas e Parácrinas da NOS no Coração
Do ponto de vista das funções autócrinas e
parácrinas, os diferentes tipos de células compreendendo
o músculo cardíaco, expressam um ou mais
das três isoformas (nNOS, ecNOS ou iNOS) da óxido
nítrico sintetase.
A NOS é expressa em terminações simpáticas
normais e regula a liberação de catecolaminas no
coração.
A ecNOS expressas nas células endoteliais inibe
o tono contrátil e a proliferação de células musculares
lisas subjacentes dos vasos, inibe a agregação
plaquetária a adesão de monócitos, promove
um relaxamento diastólico, e diminuição do consumo
de oxigênio no músculo cardíaco através de
uma parácrina de NO. A ecNOS é, também, expressa
de modo constitucional nos miócitos cardíacos
de roedores e espécies humanas, onde ela se opõe
autocrinamente à ação inotrópica de catecolaminas
após estimulação muscarínica colinérgica e estimulação
de receptores beta-adrenérgicos.
L-ARGININA
L-NMMA
L-NAME
L-NOARG
AMINOGUANIDINA
DEXAMETASONA
célula
endotelial
Músculo
liso
NO
sangue
Fig. 2 - Inibidores da óxido nítrico sintetase (NOS).
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A transcrição genética e a expressão proteica da
iNOS, como já foi dito, são induzidas em todos os
tipos de células após a exposição a uma variedade
de citoquinas. À parte de participar na defesa
imunológica contra microrganismos intracelulares e
vírus, as grandes quantidades de NO produzidas
autócrina ou paracrinamente modulam a vasoplegia
e a depressão miocárdica característica da estimulação
do sistema imune e promove morte celular
através da apoptose. Nos miócitos cardíacos, o NO
pode regular o fluxo de cálcio tipo L e contração
através da ativação da proteína quinase dependente
do GMPc e das fosfodiesterases mediadas pelo
GMPc. Outros mecanismos independentes das elevações
do GMPc podem operar através da interação
do NO com hemeproteínas, ferro não heme, ou resíduos
livres de tiol em proteínas sinalizadoras,
enzimas ou canais iônicos. Considerando-se a
multiplicidade das isoformas da NOS expressas no
músculo cardíaco e os potenciais alvos moleculares
para o NO produzido, uma estreita regulação
molecular da expressão e atividade da NOS, ao nível
transcricional e pós-transcricional, parece ser necessária
na coordenação de muitas das funções do NO
na função cardíaca na saúde e na doença (21).
Disfunção Endotelial no Transplante Cardíaco
Várias investigações têm mostrado a expressão
da iNOS no ambiente de rejeição aguda e crônica
em modelos experimentais de transplante cardíaco.
Demonstrou-se que a expressão da iNOS ocorre em
macrófagos infiltrantes e miócitos, durante a rejeição
em corações de ratos Lewis or Wistar-Furth em
receptores da raça Wistar (22). A inibição da iNOS
melhora a rejeição aguda ao transplante cardíaco.
Para determinar a evolução temporal e a localização
celular da expressão da iNOS durante o progresso
histológico da rejeição aguda de corações transplantados
em ratos, tecido de transplantes singênicos
(ratos de mesma linhagem genética) e alogênicos
(linhagens genéticas diferentes) foram colhidos do
terceiro ao décimo dias do pós-operatório e analisados
para a expressão do RNAm da iNOS. O RNAm
e a atividade enzimática da iNOS foram expressos
no transplante durante rejeição aguda leve, moderada
e severa (do quarto ao décimo dias), mas não
foram detectados em ratos normais, isogênicos ou
alogênicos, antes das mudanças histológicas da
rejeição aguda leve (terceiro dia do pós-operatório).
A expressão da iNOS resultou no aumento sérico
dos níveis de nitrito/nitrato durante rejeição leve e
moderada(do quarto ao sexto dia do pós-operatório),
e foram localizadas células inflamatórias
mononucleares infiltrando partes do tecido transplantado
durante todos os estágios da rejeição, mas
não foram detectadas nas células parenquimais
enxertadas, normais ou em enxertos isogênicos.
Assim, a expressão da iNOS e aumento da produção
de NO ocorreram durante o estágio precoce da
rejeição aguda, persistiu inalterada durante todo o
processo de rejeição, e detectaram-se células inflamatórias,
mas não células parenquimais enxertadas,
durante todos estágios da rejeição aguda (23).
A rejeição aguda primária está associada com aumento
da produção de NO nos tecidos transplantados,
mas desconhece-se se isto impede ou aumenta
a perda de função do enxerto. O L-NAME, um inibidor
não específico da NOS ,diminui a sobrevivência do
enxerto de 9.4±1.5 para 6.9±0.3 dias. A histopatologia
de corações transplantados, em assistolia,
mostrou predominantemente necrose isquêmica. LNAME
combinado com uma droga anti-hipertensiva
reabilita o tempo de rejeição (de 8.6±0.4 a 14.2±3.2
dias) e resulta numa rejeição aguda padrão. Este
dado sugere que bloqueando-se a formação de NO
durante a rejeição aguda de um enxerto cardíaco
vascularizado resulta numa diminuição no tempo de
sobrevivência do enxerto e necrose isquêmica, muito
provável secundária à vasoconstrição sustentada (24).
Tratamento contínuo com aminoguanidina, um
inibidor seletivo da produção de NO pela iNOS,
atenuou a rejeição aguda ao transplante cardíaco.
Um modelo de transplante em rato foi usado para
determinar: 1) quando iNOS foi expressa no transplante
de coração durante a rejeição natural aguda;
2) se a pulsoterapia com aminoguanidina atenuou
as mudanças histológicas provocadas pela rejeição
aguda, em comparação com os efeitos da pulsoterapia
com corticóides. Neste estudo o RNAm e
proteína da iNOS foram expressos durante a rejeição
aguda precoce e tardia. A pulsoterapia com
aminoguanidina inibiu a produção de NO e atenuou
as mudanças histológicas da rejeição aguda, mas
não efetivamente como a terapia corticóide. Concluí-
se que: 1) primeiro a expressão da iNOS ocorre
durante a rejeição aguda ao transplante precoce e
persiste durante toda rejeição e; 2) O NO é uma
importante molécula efetora na rejeição aguda.
Então, inibição da NOS pode oferecer uma terapêutica
auxiliar no controle da rejeição aguda (25). Evidências
recentes indicam que o NO modula permeabilidade
vascular sujeita a condições fisiológicas e
patofisiológicas. A inibição da iNOS com aminoguanidina
preveniu ou atenuou a disfunção da barreira
vascular no transplante cardíaco e na circulação
sistêmica e reduziu os níveis nitrito/nitrato de transplantes
alogênicos para níveis semelhantes ao encontrados
em transplantes isogênicos. A aminoguanidina
não afetou as mudanças histológicas leves da
rejeição presente nos transplantes. Este resultado
mostra novas observações: 1) a função da barreira
endotelial está comprometida em vasos sistêmicos,
particularmente no cérebro, distante do local de
rejeição ao transplante; 2) a disfunção da barreira
vascular no transplante está associada com aumen60
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to da produção de NO e expressão do RNAm da
iNOS nos tecidos afetados (por exemplo, pulmões
nativos e corações transplantados) e; 3) a inibição
da produção de NO pela iNOS previne a disfunção
da barreira vascular no transplante cardíaco e vasos
sangüíneos sistêmicos (26). Um outro estudo examinou
a interação de corticóides, expressão gênica e
atividade enzimática da iNOS num modelo de transplante
cardíaco em ratos. O aumento da produção
de NO na rejeição ao enxerto foi demonstrado pela
elevação nos níveis séricos de nitrito/nitrato, foram
significantemente reduzidos pela pulsoterapia com
dexametasona por dois dias prévios ao sacrifício
animal ou pelo tratamento contínuo com dexametasona.
Demonstrou-se um aumento da atividade
enzimática enxerto cardíaco, o qual foi significantemente
reduzido com pulsoterapia ou terapia contínua
de dexametasona. O aumento da atividade enzimática
da iNOS em tecidos alogênicos resultou da
indução da expressão do RNAm da iNOS, que foi
99% inibida pelo tratamento com dexametasona. A
pulsoterapia com dexametasona reduziu mas não
eliminou as mudanças histológicas da rejeição aguda.
Portanto, tratamento com corticóide resulta em
inibição da expressão da iNOS durante a rejeição ao
enxerto. Estes resultados demonstram que a expressão
da iNOS durante rejeição aguda é imunomediada
e sugere que a ação imunossupressora
dos corticóides no tratamento da rejeição aguda
pode incluir inibição da expressão da iNOS (27).
Transplantes alogênicos em ratos Lewis foram tratados
na hora do transplante com FK 506, ciclosporina
A, dexametasona ou uma combinação das
três drogas. Evidência histológica de rejeição e os
níveis de RNAm e atividade enzimática da iNOS no
homogenato ventricular foram significantemente reduzidas
abaixo daquelas observadas no enxerto não
tratado. Assim, os dados obtidos em modelos de
transplantes em ratos indicam que drogas imunossupressoras
reduzem o RNAm e a atividade enzimática
da iNOS miocárdica na rejeição ao enxerto
cardíaco. Os resultados coincidem com a hipótese
de que a resposta aloimune e citoquinas liberadas
estão envolvidas na expressão de iNOS durante
rejeição ao transplante cardíaco (28). Usando ratos
geneticamente desprovidos de iNOS como receptores
num modelo de transplante cardíaco, num modelo
de rejeição aguda, a iNOS foi predominantemente
localizada em tecidos infiltrados por células imunológicas
. No sétimo dia, enxertos em receptores
deficientes da iNOS mostraram redução nos infiltrados
inflamatórios e nas lesões de miócitos, resultando
em significante baixa na rejeição. Em contraste,
num modelo de rejeição crônica localizou-se
expressão adicional de iNOS em células parenquimatosas
dos enxertos. Após 55 dias, enxertos em
ratos deficientes de iNOS mostraram mais infiltrados
e destruição parenquimais que os tipos controle;
alterações essas associadas a uma significante diminuição
da contratilidade ventricular. Assim, a
iNOS promove rejeição aguda mas previne a crônica.
Estes efeitos opostos durante a rejeição aguda
e crônica ao enxerto cardíaco são dependentes do
padrão de expressão temporal e regional da iNOS
durante ambas formas de rejeição (29). Os mecanismos
através dos quais a NOS media a via de
regulação da falência do enxerto na rejeição aguda
cardíaca são dificilmente definidos. Usando ratos
desprovidos de iNOS, demonstrou-se que a via
mediada pela iNOS pode promover rejeição aguda,
pelo menos em parte, pela indução de morte celular
apoptótica (30-32).
A precoce e persistente estimulação de iNOS
em rejeição cardíaca crônica e a coincidente redução
na aterosclerose e inibição de iNOS sugerem
que esta indução regulatória pode contribuir para a
resposta inflamatória mediando, assim, a maior
tendência de aterosclerose em transplantes (33). O
RNAm e a proteína da iNOS estão presentes na
artéria coronária de humanos transplantados de
coração com aterosclerose acelerada (AA). A iNOS
expressou-se em células morfologicamente compatíveis
com macrófagos na neo-íntima de 7 de 10 dos
vasos examinados com transplantados com AA. Em
contraste, a iNOS esteve ausente em 5 artérias
coronárias nativas com aterosclerose e ausente em
2 artérias coronárias normais. Embora a iNOS expresse-
se em macrófagos em AA, e supra-regulada
em enxertos com aterosclerose, seu papel funcional
na patogênese da aterosclerose no transplante não
é claro. Sua expressão pode regular o desenvolvimento
de lesão por modular a resposta aloimune
precoce e/ou espessamento mio-intimal tardio. Usando
um modelo experimental com rato deficiente em
NOS foi possível determinar que a iNOS tem papel
protetor no desenvolvimento de aterosclerose em
transplantes, suprimindo o acúmulo neo-intimal de
células musculares lisas (34, 35). A iNOS é estimulada
na doença coronariana do transplante humano
(DCTH), que é a maior causa de mortalidade tardia
depois do transplante cardíaco. Estudos em 15
pacientes com DCTH e 10 com artérias coronárias
normais, evidenciaram que as artérias normais não
tiveram evidente a expressão da iNOS. Em contraste,
30 de 36 segmentos de artéria coronária com
DCTH (83%) apresentaram evidências desta isoforma
da NOS. Marcadores específicos identificaram células
iNOS positiva com macrófagos e células musculares
lisas. Além disso, a imunoreatividade à
nitrotirosina destas células foi positiva, significando
atividade do peroxinitrito. Estes estudos mostraram
que a proteína e o RNAm da iNOS expressam-se
em artérias humanas com DCTH, onde elas estão
associadas com extensiva nitração de proteínas
tirosinas. Estes achados indicam que o alto débito
da via do NO e, possivelmente o oxidante peroxi61
Viaro F & Évora PRB - Expressão das óxido nítrico sintetases na vasculopatia coronariana do transplante cardíaco. Rev Bras Cir
Cardiovasc 2000; 15 (1): 55-65.
nitrito, talvez estejam envolvidos no processo que
leva ao desenvolvimento de DCTH (36).
A depressão na função contrátil, durante períodos
de rejeição aguda, pode ocorrer em corações
transplantados (37).
Miócitos de corações rejeitados também expressam
iNOS. Um defeito intrínseco, devido ao aumento
da produção de NO pelos miócitos, poderia ser
responsável por muitas das disfunções contráteis
observadas. Como esta disfunção pode ser revertida
pela aminoguanidina e azul de metileno, sugeriu-
se que miócitos isolados de corações rejeitados
possam ter uma reversível depressão contrátil intrínseca,
a qual é mediada pela superestimulação
da via óxido nítrico/cGMP dentro dos miócitos. Esta
disfunção contrátil intrínseca pode ser o maior fator
responsável pela reversibilidade da depressão cardíaca
associada com rejeição aguda de corações
transplantados (38). Além disso, o NO derivado de
doador de NO e de endotélio coronariano mostrouse
capaz de reduzir a pressão diastólica final no
coração humano, especialmente durante estimulação
beta-adrenérgica, por causa do começo precoce do
relaxamento do ventrículo esquerdo (VE). Estudos
em biópsias endomiocárdicas de 16 receptores de
transplante, que estavam livres de rejeição ou
vasculopatia do enxerto, mostraram que expressão
gênica da iNOS miocárdica no enxerto alogênico
humano influencia a resposta contrátil à estimulação
beta-adrenérgica (dobutamina) através do início
precoce de relaxamento do VE e redução da sua
pressão diastólica final. Estes efeitos são similares
aos efeitos contráteis no VE de NO derivado de
doadores de NO ou de endotélio coronário (39).
COMENTÁRIOS FINAIS
Uma verificação da Universidade de Stanford,
procurou determinar se a incidência e a gravidade
da DAC do transplante, detectada mediante ecografia
intracoronária nos receptores de transplante de
coração e pulmão, são menores que as encontradas
nos receptores. Estudaram o ramo interventricular
anterior mediante a ecocardiografia intracoronária
em 22 receptores de transplante de coração e pulmão
no momento da angiografia coronária anual de controle.
Vinte e dois receptores de transplante cardíaco
se igualaram aos casos com respeito ao número
de anos após o transplante no estudo ecográfico, a
idade do receptor e do doador, e o diagnóstico de
miocardiopatia não isquêmica. Em cada grupo foi
medida e calculada a média da área e índice da
íntima, a classe Stanford, e a incidência da doença
ao menos moderada (classe > 3 de Stanford), comparando-
as entre os 2 grupos. A área média da
íntima, o índice médio da íntima, a média da classe
Stanford, e a incidência de classe 3 ou maior de
Stanford foram significativamente menores no grupo
receptor de transplante de coração e pulmão (40).
Esta observação é curiosa, permitindo especular se
este fato decorre de uma menor manipulação do
coração no transplante coração-pulmão ou, se, de
alguma forma, a substituição de um pulmão doente
poderia interferir na resposta inflamatória e/ou
humoral do organismo receptor.
Dentro do estudo cooperativo ítalo-americano,
já mencionado na introdução desta revisão, observaram-
se em autópsias e na repetição do transplante,
a freqüência e as características da trombose
coronária em 76 aloenxertos cardíacos: 37 foram
colocados durante 2 meses ou menos (precoce) e
39 durante 2 a 99 meses (tardio). Os 76 aloenxertos
foram insertados em 69 pacientes: 1 em 56 pacientes,
e 2 aloenxertos em 13 pacientes, 7 dos quais
faleceram posteriormente e foram submetidos à autópsia.
Foram examinados 140 cortes de 70 segmentos
de 5 mm de longitude de 8 artérias coronárias
epicárdicas de cada um dos 76 aloenxertos, tanto
com hematoxilina-eosina como com coloração pentacrômica
Movat. Somente encontrou-se trombos em
uma (33%) artéria coronária (à direita) dos 37 aloenxertos
precoces, e em 24 (61%) de 39 aloenxertos
tardios. Destes últimos 39 enxertos, 29 (79%) tiveram
uma vasculopatia do aloenxerto e 24 (83%)
deles, trombose coronária. Das 312 artérias coronárias
(4 maiores e 4 menores) examinadas nos 39
casos tardios, 66 (21%) artérias tinham trombo. Dos
24 casos com trombo ao menos em uma artéria,
encontrou-se trombos em 66 (34%) das artérias
coronárias epicárdicas examinadas: em 6 das 8
artérias em 3 pacientes; em 5 artérias em 2 pacientes;
em 4 artérias em 1 paciente; e em 1 só artéria
em 7 pacientes. Nas 66 artérias com trombo (24
pacientes), o trombo foi maior que 5mm. Os trombos
nos casos tardios foram totalmente não oclusivos
(mural) em 51 (77%) das 55 artérias coronárias epicárdicas
que continham trombo e totalmente oclusivo
em 10 (15%) artérias. Constou exclusivamente de
canais multiluminais em 6 artérias (9%) e combinações
em 1 (2%). Encontraram-se infartos agudos do
miocárdio em 3 pacientes, todos eles com trombos
oclusivos. Nas 10 artérias com trombos oclusivos sob
placas ulceradas. Essas observações demonstraram
que o trombo é freqüente nas artérias coronárias
epicárdicas, ao menos dois meses após o transplante
cardíaco, podendo significar uma disfunção
endotelial tardia ou não regeneração de possíveis
lesões endoteliais conseqüentes ao processo do transplante
cardíaco (41).
Interessante pesquisa americana utilizou a imunohistoquímica
para investigar o papel da endotelina
1 na cardiopatia coronária do transplante.
Foram avaliadas a imunoreatividade e a localização
62
Viaro F & Évora PRB - Expressão das óxido nítrico sintetases na vasculopatia coronariana do transplante cardíaco. Rev Bras Cir
Cardiovasc 2000; 15 (1): 55-65.
celular da endotelina 1 em artérias coronárias humanas
com arteriopatia coronária de transplante
(n=3) e em artérias coronárias normais (n=10)
mediante imunohistoquímica de marcação simples e
dupla. A intensidade da imunocoloração foi determinada
com um método semi-quantitativo. Foi encontrada
imunoreatividade difusa e intensa da endotelina
1 em 11 (85%) de 13 pacientes com arteriopatia
coronária de transplante, fundamentalmente em
células mioíntimas, e em menor quantidade nos
macrófagos e nas células endoteliais. Ao contrário,
as artérias coronárias normais somente apresentaram
uma tênue imunocoloração localizada na camada
endotelial. A média semiquantitativa do grau foi
maior na arteriopatia coronária do transplante do
que nas artérias normais (1,8 frente a 0,7). A
endotelina 1 foi encontrada com mais freqüência
nas lesões ateromatosas, ricas em lipídios, que nas
proliferativas, pobres em lipídios. Os novos vasos
da íntima se imunotingiram constantemente para
endotelina 1. Assim, estes dados sugerem que a
imunorreatividade para a endotelina aumenta significativamente
na cardiopatia coronária de transplante,
possivelmente como conseqüência das citoquinas
e os fatores de crescimento estimulantes, que se
supra-regulam no estado pós-transplante. Estes
resultados sugerem um possível papel deste peptídeo
mitógeno na patogênese da aterosclerose de
enxerto (42). Um estudo da Mayo Clinic procurou
avaliar o comportamento dos níveis de endotelina e
do fator atrial natriurético na evolução precoce de
transplantes cardíacos em cães. A idéia inicial era
verificar se o comportamento destes fatores poderia
ser correlacionado com o processo de rejeição. Observou-
se um progressivo aumento, tanto da endotelina
como do fator atrial natriurético. Mas, como
todos os cães desenvolveram insuficiência cardíaca,
que cursa com o aumento dos mencionados fatores,
não foi possível estabelecer, com certeza um papel
de “marcador” de rejeição (Pearson, Evora, Schaff,
dados não publicados, 1990) (Figura 3).
Na revisão sobre o papel das NOSs, ficou claro
que a expressão da iNOS é a que mais se relaciona
com o processo de rejeição pós-transplante cardíaco.
Como em outras doenças cardiovasculares a
expressão desta enzima é, aparentemente, antagônica.
Ora parece ter um papel protetor, ora parece
relacionar-se com processos patológicos. Um detalhe
importante pode ser extraído destas observações:
no transplante cardíaco a iNOS promove rejeição
aguda mas previne a rejeição crônica. Assim,
a iNOS, como vários “heróis”, começa como “vilã”,
converte-se e torna-se uma grande “heroína”. Qual
seria a ligação entre estes efeitos completamente
opostos? Parece, pelo menos, que são mecanismos
diferentes dependentes do tempo.
O uso clínico da ciclosporina (CsA) tem melhorado
muito os resultados dos transplantes de órgãos.
Contudo, a CsA pode causar nefrotoxicidade
e hipertensão. A administração de CsA resulta num
significante aumento na pressão sangüínea arterial
(PA) junto com uma diminuição na excreção urinária
de Nox, sugerindo uma produção de NO deprimida.
Isto acompanha-se de uma significante redução na
proteína iNOS existente no rim e aorta torácica, mas
não ocorre mudança no teor da proteína ecNOS. A
queda na proteína iNOS renal em ratos tratados
com CsA foi acompanhada por um declínio paralelo
do RNAm da iNOS e atividade enzimática. Em conclusão,
administração de CsA por três semanas
resultou em um significante aumento na PA junto
com marcada redução na excreção urinária de NOX,
e expressão de iNOS renal e vascular. Estas observações
sugerem que a hipertensão induzida pela
CsA pode estar, em parte, relacionada com defeito
ENDOTELINA E FATOR ATRIAL NATRIURÉTICO
DURANTE REJEIÇÃO AGUDA APÓS TRANSPLANTE
CARDÍACO EM CÃES.
* P , 0.05 V.S CONTROLE
DIA DO PÓS-OPERATÓRIO
FATOR ATRIAL NATRIURÉTICO
(% do Controle)
ENDOTELINA
(% do Controle)
400
300
200
100
0
600
500
400
300
200
100
0
C S 1 2 3 4 5 6 7
C S 1 2 3 4 5 6 7
Fig. 3 - Endotelina e Fator Atrial Natriurético durante rejeição aguda
de transplante cardíaco em cães (Pearson, Evora, Schaff,
1990 - Dados não publicados e apresentados com permissão).
63
Viaro F & Évora PRB - Expressão das óxido nítrico sintetases na vasculopatia coronariana do transplante cardíaco. Rev Bras Cir
Cardiovasc 2000; 15 (1): 55-65.
na produção de NO. Se verdade, estratégias planejadas
para restaurar a disponibilidade de NO podem
suavizar a hipertensão e outras complicações vasculares
da terapia com CsA (43). Estudos relacionando
a disfunção endotelial em corações transplantados
com a utilização da CsA e de outras drogas
poderão mostrar dados interessantes e estabelecer
se os seus efeitos contra a rejeição possam ser em
detrimento do controle do tono e o aparecimento da
DAC do transplante.
Para concluir seria importante incluir alguma
informação geral sobre terapêutica genética e tentar
analisar as particularidades da expressão da NOS
de acordo com o tipo de doença cardiovascular. A
terapêutica genética envolve a transferência de um
gene funcional para células hospedeiras com a finalidade
de corrigir a disfunção de um gene específico
ou aliviar os sintomas da doença. Para a transferência
gênica no sistema cardiovascular, a utilização de
adenovírus vetores vem a ser o recurso mais eficiente.
Recentemente, a transferência e expressão
funcional de genes recombinantes da NOS para o
cérebro e leitos vasculares tem sido demonstrada
tanto in vitro como in vivo. Estudos têm demonstrado,
com sucesso, a transferência de ecNOS RNAm
em artérias coronárias de porcos como se verifica
pela localização histoquímica de proteína recombinante
com um aumento da liberação de NO, demonstrada
pelo aumento da produção de nitrito e
alteração da função vasomotora. Apesar da possibilidade
da transferência gênica está sendo demonstrada
em modelos animais. Os vetores atualmente
disponíveis apresentam grandes limitações técnicas
e de segurança, as quais precisam ser resolvidas
antes de se tentar a terapêutica genética com a
NOS em humanos para o tratamento de doenças
vasculares proliferativas. Mais de 100 protocolos
têm sido propostos para a terapêutica genética em
humanos nos Estados Unidos, mas nenhum resultado
efetivo tem sido apresentado neste campo. As
deficiências da terapêutica genética resultam, principalmente,
da falta de vetores eficientes de transferência
gênica. Acresça-se que, quanto mais longínqua se
encontre a terapêutica genética somática, mais difícil
será o controle das doenças sistêmicas, mesmo após
o desenvolvimento de sistemas vetores mais poderosos.
Entretanto, doenças localizadas poderão ser
melhor controladas pela terapêutica genética. A este
respeito, as doenças cardiovasculares serão alvos
promissores para a terapêutica gênica (44, 45).
RBCCV 44205-487
Viaro F & Evora PRB - Expression of nitric oxide synthases in coronary artery disease after heart
transplantation. Rev Bras Cir Cardiovasc 2000; 15 (1): 55-65.
ABSTRACT: A major complication that can limited the evolution of a cardiac transplantation over the long
term is the development of accelerated coronary arteriosclerosis. This form of coronary disease is different
from the atherosclerotic coronary disease of patients not submitted to cardiac transplantation. Current
evidence obtained by intravascular ultrasound, has demonstrated that the occurrence of a precocious
endothelial dysfunction, mainly mediated by the inducible isoform of the nitric oxide synthase (iNOS)
expression, is associated with the development of atherosclerosis in cardiac allografts during the first year of
the transplant. This review was developed starting with basic concepts (description of the enzyme and its
known isoforms; a brief comparison between them), reviewing the coronary endothelial dysfunction after
cardiac transplantation, from the specific point of view of the NOS enzymatic function. In cardiac transplantation
iNOS promotes acute rejection but prevents chronic episodes. The relationship between these opposing
effects remains unknown we only know that they are different mechanisms which are time-dependent.
DESCRIPTORS: Nitro-oxide synthese, metabolism. Endothelium, vascular, enzymology. Heart transplantation,
physiology. Graft rejection, enzymology.
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