Quim. Nova, Vol. 29, No. 1, 113-123, 2006
Divulgação
*e-mail: jmdavid@ufba.br
André L. B. S. Barreiros e Jorge M. David*
Instituto de Química, Universidade Federal da Bahia, 40170-290 Salvador-BA
Juceni P. David
Faculdade de Farmácia, Universidade Federal da Bahia, 40170-290 Salvador-BA
Recebido em 1/7/04; aceito em 18/5/05; publicado na web em 24/8/05
OXIDATIVE STRESS: RELATIONS BETWEEN THE FORMATION OF REACTIVE SPECIES AND THE ORGANISM’S
DEFENSE. This work describes the mechanism of action of some reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species
(RNS) in the oxidative stress of the human body, and their consequences on damage to DNA, RNA, proteins and lipids. It also
illustrates the defense system of our organism against these ROS and RNS species. The action of nonenzymatic protection systems
is reported, with emphasis on micromolecules like Q10 coenzyme, vitamin C, α-tocopherol, carotenoids and flavonoids. The
importance of flavonoids is also emphasized, and their body protection mechanism is detailed.
Keywords: oxidative stress; antioxidants; reactive species.
INTRODUÇÃO
Atualmente existe um grande interesse no estudo dos antioxidantes
devido, principalmente, às descobertas sobre o efeito dos
radicais livres no organismo. A oxidação é parte fundamental da
vida aeróbica e do nosso metabolismo e, assim, os radicais livres
são produzidos naturalmente ou por alguma disfunção biológica.
Esses radicais livres cujo elétron desemparelhado encontra-se
centrado nos átomos de oxigênio ou nitrogênio são denominados
ERO ou ERN1-4. No organismo, encontram-se envolvidos na produção
de energia, fagocitose, regulação do crescimento celular, sinalização
intercelular e síntese de substâncias biológicas importantes.
No entanto, seu excesso apresenta efeitos prejudiciais, tais
como a peroxidação dos lipídios de membrana e agressão às proteínas
dos tecidos e das membranas, às enzimas, carboidratos e DNA5.
Dessa forma, encontram-se relacionados com várias patologias, tais
como artrite, choque hemorrágico, doenças do coração, catarata,
disfunções cognitivas, câncer e AIDS, podendo ser a causa ou o
fator agravante do quadro geral6.
O excesso de radicais livres no organismo é combatido por
antioxidantes produzidos pelo corpo ou absorvidos da dieta. De
acordo com Halliwell3 “Antioxidante é qualquer substância que,
quando presente em baixa concentração comparada à do substrato
oxidável, regenera o substrato ou previne significativamente a oxidação
do mesmo”. Os antioxidantes produzidos pelo corpo agem
enzimaticamente, a exemplo da GPx, CAT e SOD2 ou, nãoenzimaticamente
a exemplo de GSH, peptídeos de histidina, proteínas
ligadas ao ferro (transferrina e ferritina), ácido diidrolipóico e
CoQH2. Além dos antioxidantes produzidos pelo corpo, o organismo
utiliza aqueles provenientes da dieta como o a-tocoferol (vitamina-
E), β-caroteno (pro-vitamina-A), ácido ascórbico (vitamina-
C), e compostos fenólicos onde se destacam os flavonóides e
poliflavonóides4,7. Dentre os aspectos preventivos, é interessante
ressaltar a correlação existente entre atividade antioxidante de substâncias
polares e capacidade de inibir ou retardar o aparecimento
de células cancerígenas, além de retardar o envelhecimento das
células em geral8. Outro interesse ligado aos antioxidantes é a sua
aplicação na indústria, para a proteção de cosméticos, fármacos e
alimentos, prevenindo a decomposição oxidativa desses pela ação
da luz, temperatura e umidade9.
O ESTRESSE OXIDATIVO
O organismo humano sofre ação constante de ERO e ERN geradas
em processos inflamatórios, por alguma disfunção biológica ou
provenientes dos alimentos. As principais ERO distribuem-se em
dois grupos, os radicalares: hidroxila (HO•), superóxido (O2
•−),
peroxila (ROO•) e alcoxila (RO•); e os não-radicalares: oxigênio,
peróxido de hidrogênio e ácido hipocloroso. Dentre as ERN incluem-
se o óxido nítrico (NO•), óxido nitroso (N2O3), ácido nitroso
(HNO2), nitritos (NO2
−), nitratos (NO3
−) e peroxinitritos (ONOO−)10.
Enquanto alguns deles podem ser altamente reativos no organismo
atacando lipídios, proteínas e DNA, outros são reativos apenas com
os lipídios. Existem ainda alguns que são pouco reativos, mas apesar
disso podem gerar espécies danosas.
O radical HO• é o mais deletério ao organismo, pois devido a
sua meia-vida muito curta dificilmente pode ser seqüestrado in
vivo. Estes radicais freqüentemente atacam as moléculas por abstração
de hidrogênio e por adição a insaturações. Nos experimentos
de laboratório o HO• pode facilmente ser seqüestrado in vitro
por inúmeras moléculas, devido a sua alta reatividade. No entanto,
para que os resultados in vitro se reproduzam in vivo, é necessário
ministrar alta concentração do antioxidante para que este
alcance o local onde o radical HO• está presente em concentração
suficiente para suprimí-lo. Existem duas maneiras de controlar a
presença do radical HO•: reparar os danos causados por ele ou
inibir sua formação.
O radical HO• é formado no organismo principalmente por dois
mecanismos: reação de H2O2 com metais de transição e homólise
da água por exposição à radiação ionizante6 (Equação 1). A incidência
de radiação no ultravioleta, radiação γ e raios X podem produzir
o radical HO• nas células da pele. O ataque intensivo e freqüente
deste radical pode originar mutações no DNA e, conseqüentemente,
levar ao desenvolvimento de câncer em seres humanos no
período de 15 a 20 anos.
luz UV H2O HO• + H• (1)
114 Barreiros et al. Quim. Nova
O peróxido de hidrogênio isoladamente é praticamente inócuo,
porém pode se difundir facilmente através das membranas
celulares como, por ex., a membrana do núcleo. Devido ao fato da
célula possuir metais de transição, ocorre geração do radical HO•
em seu interior5 (Equação 2).
Mn+ + H2O2 M(n+1)+ + HO• + HO– (2)
Em nosso organismo, os metais de transição mais importantes
para a ocorrência dessa reação são Cu1+ e Fe2+. Nesse sistema, a
importância do ferro é mais pronunciada devido a sua maior
biodisponibilidade e, no organismo, na maior parte do tempo ele
encontra-se complexado com proteínas de transporte (ex. transferrina),
e armazenamento (ex. ferritina e hemosiderina). A reação
do Fe2+ com o H2O2 (reação de Fenton) pode ser representada de
maneira simplificada na Equação 3 ou de forma mais complexa na
Equação 4.
Fe2+ + H2O2 Fe3+ + HO• + HO– (3)
(4)
O radical hidroxila causa danos ao DNA, RNA, às proteínas,
lipídios e membranas celulares do núcleo e mitocondrial. No DNA
ele ataca tanto as bases nitrogenadas quanto a desoxirribose (Figura
1). O ataque ao açúcar pode ser realizado por abstração de
um dos átomos de hidrogênio (1-3) e quase sempre leva à ruptura
da cadeia de DNA10. O mecanismo dessa ruptura tem como principais
produtos 5’-8-ciclo-2’-desoxiadenosina 8OHdA (4) e 5’-
8-ciclo-2’-desoxiguanosina 8OHdG (5). A eletrofilicidade do HO•
possibilita sua interação com as bases nitrogenadas por adição às
insaturações em sítios de alta densidade eletrônica. Assim, reage
com as bases púricas por adição a C-4 e C-8, e em menor proporção
com C-5, gerando 2,6-diamino-4-hidroxi-5-
formamidopirimidina (FapyG) (6), 4,6-diamino-5-formamidopirimidina
(FapyA) (7), 8-oxo-7,8-diidro-2’-desoxiguanosídeo (8-
oxoG) (8), 8-oxoA (9)11 (Figura 1). O ataque às bases pirimidínicas
dá-se por adição à ligação dupla Δ5,6, e produz os radicais livres
em C-6 e C-5 nas proporções aproximadamente de 70 e 30%,
respectivamente (14 e 15), gerando 5-hidroxi-6-hidrocitosina (16),
6-hidroxi-5-hidrocitosina (17), 5-hidroxi-6-peroxicitosina (20),
6-hidroxi-5-peroxicitosina (21), 5-hidroxi-6-oxocitosina (22) e 6-
hidroxi-5-oxocitosina (23). Os radicais peroxila (18 e 19) podem
decompor-se gerando citosinaglicol (24) como produto majoritário.
A timina sofre a adição do radical à ligação dupla Δ5,6, formando
os radicais livres em C-5 e C-6 (25 e 26), e em menor teor
o radical decorrente da abstração de um próton da metila em C-5
(27), que gera 5-hidroxi-6-hidrotimina (28), 6-hidroxi-5-
hidrotimina (29), 5-hidroxi-6-oxotimina (36) e timinaglicol (37)
como principais produtos10. A fragmentação completa da citosina
e da timina é mostrada na Figura 2.
Nos aminoácidos e proteínas, HO• pode reagir na cadeia lateral,
onde ataca preferencialmente cisteína, histidina, triptofano,
metionina e fenilalanina, e, em menores proporções, arginina e
asparagina11. Os ataques aos aminoácidos que compõem as proteínas
podem gerar danos como clivagens de ligações com ou sem
Figura 1. Principais produtos da oxidação do DNA por ERO e ERN geração de fragmentos e ligações cruzadas, o que pode ter como
Figura 2. Fragmentação oxidativa das bases pirimidínicas
Vol. 29, No. 1 Estresse Oxidativo: Relação entre Geração de Espécies Reativas 115
conseqüência perda de atividade enzimática, dificuldades no transporte
ativo através das membranas celulares, citólise e morte celular.
O ataque ocorre por adição do radical ou por abstração de hidrogênio.
Todos os aminoácidos podem sofrer abstração do hidrogênio
do carbono Cα -COO− ligado ao carboxilato e ao grupo amino.
Essa abstração, com exceção da glicina, leva à perda de CO2 e
formação de carbono radicalar11. Na Figura 3 são mostrados os
principais produtos dessas reações, destacando-se o tiohidroperóxido
(42), cistina (43)12, 2-oxo-histidina (44) em equilíbrio
com a 2-hidroxi-histidina (45)13, metionina sulfóxido (46),
metionina sulfona (47)14, derivados da arginina, lisina e prolina
(48, 49 e 50), nitroacetato (51), oxima (52), hidroxilamina (53)14,
oxalato (54)11 e derivados da tirosina (55-60).
O exemplo mais comum do ataque de radicais hidroxila a
lipídios é a ação deste nos lipídios de membrana. Os radicais livres
centrados no oxigênio (HO•) atacam a cadeia lipídica em sítios
susceptíveis como o grupo metilênico alílico, convertendo-o em
novo centro de radical livre. O carbono radicalar facilmente adiciona
oxigênio gerando o radical lipídio-peroxila, que pode facilmente
atacar as proteínas de membrana, produzindo danos nas células
A Figura 6 traz exemplos dessa atuação. Os ácidos graxos
poliinsaturados são mais susceptíveis ao ataque por radicais livres,
devido ao carbono metilênico bis-alílico. O radical formado pela
abstração do hidrogênio gera os ácidos decadienóicos HPODE, 13-
Z,E-HPODE (61), 9-E,Z-HPODE (62), 9-E,E-HPODE (63) e 13-
E,E-HPODE (64) e a decomposição destes gera os aldeídos α,β-
insaturados 4-hidroperoxi-2-nonenal (65), 4-hidroxi-2-nonenal (66),
4-oxo-2-nonenal (67) e 4,5-epóxi-2(E)-decenal (68). Aldeídos α,β-
insaturados são conhecidos por sua ação genotóxica, pois em presença
do 2’-desoxiguanosídeo e do 2’-desoxiadenosídeo sofrem
adição gerando heptanona-eteno-desoxiguanosídeo (69), heptanonaeteno-
desoxiadenosídeo (70), eteno-desoxiadenosídeo (71), etenoadenosídeo
e hexanol-1,N-2-propano-desoxiguanosídeo (72). A decomposição
dos ácidos graxos com três ou mais insaturações gera
como produto adicional o aldeído malônico (73), que pode se adicionar
ao 2’-desoxiguanosídeo gerando pirimidol-[1,2a]purin-10-
ona desoxiguanosídeo (74)15 (Figura 4).
A forma mais deletéria do oxigênio ao organismo é o oxigênio
singleto (1O2), pois é a causa ou o intermediário da toxicidade
fotoinduzida do O2 em organismos vivos. O seu tempo de meiavida
depende muito do meio onde se encontra. Em meio aquoso,
sua meia-vida é muito pequena, pois ele se choca com as moléculas
de H2O transferindo sua energia, desativando-se e retornando
à forma de oxigênio tripleto. Em meio orgânico é mais comum a
ocorrência de choque com transferência de energia, sem reação
química, seguida da dissipação dessa energia na forma de calor.
Esse tipo de choque é denominado “quenching” colisional e representa
a forma como a água desativa o 1O2. Porém, em meio
orgânico, a meia-vida do oxigênio singleto é maior e, portanto,
pode causar algumas reações químicas com determinados
aceptores por incorporação do O2. O oxigênio singleto reage com
algumas classes de biomoléculas e, em geral, essas reações são
do tipo eno (Equação 5) e dieno (reações de Diels-Alder) (Equação
6). Os compostos naturais mais reativos frente ao 1O2 são os
carotenóides, devido as múltiplas insaturações conjugadas. Assim,
o 1O2 reage mais lentamente com os ácidos graxos que com o
β-caroteno, e quanto maior o número de insaturações presentes
Figura 3. Principais produtos da oxidação dos aminoácidos e proteínas por
ERO e ERN
Figura 4. Compostos genotóxicos produzidos pela oxidação dos lipídios por
ERO e ERN, e produtos resultantes de seu ataque ao DNA
116 Barreiros et al. Quim. Nova
nos ácidos graxos, mais rapidamente eles irão reagir. Essa reação
se dá por incorporação do oxigênio à cadeia com conseqüente
migração da ligação dupla, formando ácidos hidroperóxidos como
os HPODE16 (Figura 4).
(5)
(6)
Na Figura 3 estão representados os produtos da reação do 1O2
com os aminoácidos cisteína, metionina, triptofano, tirosina e
histidina27. A reação do oxigênio singleto com os ácidos nucléicos
é significativa apenas para a base guanina, que origina 8OHG (8).
O peróxido de hidrogênio (H2O2) é pouco reativo frente às
moléculas orgânicas na ausência de metais de transição. No entanto,
exerce papel importante no estresse oxidativo por ser capaz de
transpor as membranas celulares facilmente e gerar o radical
hidroxila. Ele somente oxida proteínas que apresentem resíduos de
metionina ou grupos tiol muito reativos, GSH por ex.
O H2O2 é gerado in vivo pela dismutação do ânion-radical
superóxido (O2
• –) por enzimas oxidases ou pela β-oxidação de ácidos
graxos. As mitocôndrias são importantes fontes de O2
• – e, como
a presença deste ânion-radical pode causar sérios danos, elas são
ricas em SOD que o converte em H2O2. O peróxido de hidrogênio
gerado é então parcialmente eliminado por catalases, glutationa
peroxidase e peroxidases ligadas à tioredoxina, mas como essa eliminação
tem baixa eficiência, grande parte do H2O2 é liberado para
a célula18. O H2O2 também pode ser encontrado em bebidas como
chás e principalmente café instantâneo e, rapidamente se difunde
pelas células da cavidade oral e do trato gastrintestinal. Pode também
ser produzido por bactérias presentes na boca, sendo utilizado
pela peroxidase salivar para oxidar o tiocianeto (SCN–) em tiocianato
(OSCN–), um produto tóxico para certas bactérias. Ele é utilizado
pelos fagócitos na produção de ácidos hipoalogenosos, que são
oxidantes muito efetivos no combate a vírus, bactérias e outros corpos
estranhos, mas que por outro lado apresentam efeitos deletérios
quando expostos às moléculas biológicas14,18.
A maior fonte de energia para os organismos aeróbicos está na
terceira etapa da respiração, que ocorre no interior da mitocôndria,
onde uma molécula de O2 é reduzida a duas moléculas de H2O, com
consumo de 4 elétrons (Equação 7). Nas equações seguintes (Equações
8-11) estão descritas as etapas da redução de O2, formação de
radical hidroxila e a segunda molécula de água (Equação 11)19.
O2 + 4e– + 4H+ 2H2O (7)
O2 + e– O2
• – (8)
O2
• – + e– + 2H+ H2O2 (9)
H2O2 + e– + H+ •OH + H2O (10)
•OH + e– + H+ H2O (11)
O radical ânion superóxido (O2
• –) ao contrário da maioria dos
radicais livres é inativo. Em meio aquoso, sua reação principal é a
dismutação, na qual se produz uma molécula de peróxido de hidrogênio
e uma molécula de oxigênio (Equação 12). Ele também é
uma base fraca cujo ácido conjugado, o radical hidroperóxido
(HOO•) é mais reativo (Equação 13).
2O2
• – + 2H+ H2O2 + O2 (12)
O2
• – + H+ HOO• (13)
O radical ânion superóxido (O2
• –) participa de certos processos
químicos importantes no contexto biológico. O principal deles é
auxiliar na produção de radical HO•, através da redução de quelatos
de Fe (III) (Equação 14), formando Fe+2. Assim, o HO• pode ser
obtido através da reação de Haber-Weiss6,20 (Equação 15).
Fe3+ + O2
• – [Fe3+ – O2
– Fe2+ – O2] Fe2+ + O2 (14)
Fe O2
• – + H2O2 HO• + HO– + O2 (15)
Além disso, o radical ânion O2
• – possui a habilidade de liberar
Fe2+ das proteínas de armazenamento e de ferro-sulfoproteínas, tais
como ferritina e aconitase, respectivamente. O radical ânion O2
• –
também reage com o radical HO• produzindo oxigênio singleto 1O2
(Equação 16) e com o óxido nítrico (NO•) produzindo peroxinitrito
(ONOO−) (Equação 17).
O2
• – + •OH 1O2 + HO• (16)
NO• + O2
• – ONOO– (17)
A atuação do radical ânion superóxido (O2
• –) como oxidante
direto é irrelevante. Dentre os aminoácidos, o único que sofre oxidação
com o radical O2
• – é a cisteína. A partir dessa reação formase
um superóxido (42) e o tio-radical (43) (Figura 3)18. Além disso,
o radical ânion superóxido O2
• – presente no organismo é eliminado
pela enzima superóxido dismutase, que catalisa a dismutação de
duas moléculas de O2
• – em oxigênio e peróxido de hidrogênio (Equação
12). Este último, quando não eliminado do organismo pelas
enzimas peroxidases e catalase, pode gerar radicais hidroxila18.
Apesar destes efeitos danosos, o radical O2
• – tem importância
vital para as células de defesa e sem ele o organismo está
desprotegido contra infecções causadas por vírus, bactérias e fungos.
O radical O2
• – é gerado in vivo por fagócitos ou linfócitos e
fibroblastos durante o processo inflamatório, para combater corpos
estranhos. Os fagócitos o produzem com auxílio da enzima
leucócito NADPH oxidase, que catalisa a redução por um elétron
do O2 com gasto de uma molécula de NADPH (Equação 18)18,19.
2O2 + NADPH 2O2
• – + NADP+ + H+ (18)
O radical ânion superóxido formado é bactericida fraco, capaz
de inativar proteínas ferro-sulfurosas das bactérias, porém gera alguns
produtos que possuem forte atividade antimicrobiana, tais
como ácido hipocloroso (HOCl), peróxido de hidrogênio (H2O2) e
peroxinitrito (ONOO–) que são os principais responsáveis pelo combate
a corpos estranhos.
Em alguns casos o radical ânion O2
• – age como antioxidante,
reduzindo semiquinonas para que elas possam retomar suas atividades
metabólicas na célula. Um exemplo é a redução da ubiquinona
para ubiquinol, no interior da mitocôndria18,19.
Por fim, o radical ânion superóxido funciona como sinalizador
molecular através da sua capacidade de oxidar grupos –SH em ligações
dissulfeto (Equação 19), podendo ativar e desativar enzimas
que contenham metionina.
2O2
• – + 2RSH 2HOO– + RSSR (19)
Vol. 29, No. 1 Estresse Oxidativo: Relação entre Geração de Espécies Reativas 117
O radical óxido nítrico (NO•) pode ser produzido no organismo
pela ação da enzima óxido nítrico sintase a partir de arginina, oxigênio
e NADPH, gerando também NADP+ e citrulina21. Esse radical
também pode ser produzido em maiores quantidades através
dos fagócitos humanos, quando estimulados10,18. O nitrato pode
transformar-se em nitrito, que reage com os ácidos gástricos gerando
o ácido nitroso (HNO2). O óxido nitroso (N2O3) também é
precursor do HNO2 através da sua reação com a água. O HNO2
promove a desaminação das bases do DNA que contêm grupo
–NH2 livre que são citosina, adenina e guanina, formando-se uracila,
hipoxantina (11) e xantina (12), respectivamente (Figura 1)10. O
óxido nítrico NO• não é suficientemente reativo para atacar o DNA
diretamente, mas pode reagir com o radical ânion superóxido O2
•−,
produzido pelos fagócitos, gerando peroxinitrito. Esse último, por
sua vez, pode sofrer reações secundárias formando agentes capazes
de nitrar aminoácidos aromáticos, a exemplo da tirosina gerando
nitrotirosina (59) e as bases do DNA, em particular a guanina,
na qual o produto principal é a 8-nitroguanina (13)10,18,22. A presença
do tampão CO2/HCO3
− contribui para a nitração de biomoléculas
pois o carbonato ao ser protonado forma o radical HCO3
• e este
oxida anéis aromáticos, produzindo bicarbonato (HCO3
−) e o radical
aromático correspondente, facilitando a entrada do radical
NO2
• 23.
A PROTEÇÃO AO ORGANISMO CONTRA O ESTRESSE
OXIDATIVO
Os radicais livres promovem reações com substratos biológicos
podendo ocasionar danos às biomoléculas e, conseqüentemente,
afetar a saúde humana. Os danos mais graves são aqueles causados
ao DNA e RNA. Se a cadeia do DNA é quebrada, pode ser
reconectada em outra posição alterando, assim, a ordem de suas
bases. Esse é um dos processos básicos da mutação e o acúmulo de
bases danificadas pode desencadear a oncogênese. Uma enzima
que tenha seus aminoácidos alterados pode perder sua atividade
ou, ainda, assumir atividade diferente. Ocorrendo na membrana
celular, a oxidação de lipídios interfere no transporte ativo e passivo
normal através da membrana, ou ocasiona a ruptura dessa, levando
à morte celular. A oxidação de lipídios no sangue agride as
paredes das artérias e veias, facilitando o acúmulo desses lipídios,
com conseqüente aterosclerose, podendo causar trombose, infarto
ou acidente vascular cerebral. As proteções conhecidas do organismo
contra as ERO e ERN abrangem a proteção enzimática ou por
micromoléculas, que podem ter origem no próprio organismo ou
são adquiridas através da dieta.
As macromoléculas são representadas pelas enzimas e podem
atuar diretamente contra as ERO e ERN ou, ainda, reparar os danos
causados ao organismo por essas espécies. Um exemplo é a
catalase (CAT) que converte o peróxido de hidrogênio em H2O e
O2. Outras são capazes de eliminar a molécula ou a unidade dessa
que se encontra danificada, como por ex., as enzimas responsáveis
pela excisão das bases nitrogenadas danificadas e substituição por
outras intactas10,19. São conhecidos três sistemas enzimáticos
antioxidantes: o primeiro é composto por dois tipos de enzimas
SOD, que catalisam a destruição do radical ânion superóxido O2
•−,
convertendo-o em oxigênio e peróxido de hidrogênio. A decomposição
do radical ânion superóxido O2
•− ocorre naturalmente porém,
por ser uma reação de segunda ordem, necessita que ocorra colisão
entre duas moléculas de O2
•−, de forma que há necessidade de maior
concentração do radical ânion superóxido. A presença da enzima
SOD favorece essa dismutação tornando a reação de primeira ordem,
eliminando a necessidade da colisão entre as moléculas. A
ação desta enzima permite a eliminação do O2
•− mesmo em baixas
concentrações. Existem duas formas de SOD no organismo, a primeira
contém Cu2+ e Zn2+ como centros redox e ocorre no citosol,
sendo que sua atividade não é afetada pelo estresse oxidativo. A
segunda contém Mn2+ como centro redox, ocorre na mitocôndria e
sua atividade aumenta com o estresse oxidativo19. O segundo sistema
de prevenção é muito mais simples, sendo formado pela enzima
catalase que atua na dismutação do peróxido de hidrogênio (H2O2)
em oxigênio e água19 (Equação 20).
(20)
O terceiro sistema é composto pela GSH em conjunto com duas
enzimas GPx e GR. A presença do selênio na enzima (selenocisteína)
explica a importância desse metal e sua atuação como
antioxidante nos organismos vivos. Esse sistema também catalisa
a dismutação do peróxido de hidrogênio em água e oxigênio, sendo
que a glutationa opera em ciclos entre sua forma oxidada e sua
forma reduzida19. A GSH reduz o H2O2 a H2O em presença de GPx,
formando uma ponte dissulfeto e, em seguida, a GSH é regenerada
(Equações 21-23).
(21)
(22)
(23)
Dentre os antioxidantes biológicos de baixo peso molecular,
podem ser destacados os carotenóides, a bilirrubina, a ubiquinona
e o ácido úrico. Porém, as mais importantes micromoléculas no
combate ao estresse oxidativo são os tocoferóis e o ácido ascórbico
(vitamina C)19.
Vitamina C no ciclo oxidativo
O ácido ascórbico ou vitamina C é comumente encontrado em
nosso organismo na forma de ascorbato (75). Por ser muito solúvel
em água, está localizado nos compartimentos aquosos dos tecidos
orgânicos. O ascorbato desempenha papéis metabólicos fundamentais
no organismo humano, atuando como agente redutor, reduzindo
metais de transição (em particular Fe3+ e Cu2+) presentes nos
sítios ativos das enzimas ou nas formas livres no organismo24. Por
ser um bom agente redutor o ascorbato pode ser oxidado pela maioria
das ERO e ERN que chegam ou são formadas nos compartimentos
aquosos dos tecidos orgânicos. Sua oxidação produz inicialmente
o radical semidesidroascorbato (76), que é pouco reativo.
Esse radical pode ser reconvertido em ascorbato, ou duas moléculas
dele podem sofrer desproporcionamento originando uma molécula
de desidroascorbato (77) e regenerando uma molécula de
ascorbato. O desidroascorbato pode ser então regenerado para
ascorbato através de um sistema enzimático, ou ser oxidado
irreversivelmente gerando oxalato (78) e treonato (79)19,24 (Figura
5). Tendo em vista que o ascorbato converte as ERO e ERN em
espécies inofensivas e que os derivados do ascorbato são pouco
reativos, esse age como antioxidante in vivo. Devido a estas propriedades,
muitos autores sugerem a ingestão diária de doses maiores
de ascorbato, para proteção contra o desenvolvimento de doenças
crônicas, cardiovasculares e de alguns tipos de câncer24.
O ascorbato possui também propriedades pró-oxidantes pois
os íons Fe2+ e Cu1+ reagem com o peróxido de hidrogênio (reação
de Fenton, Equação 3) gerando o radical hidroxila. Indiretamente,
o ascorbato pode induzir as reações de radicais livres.
118 Barreiros et al. Quim. Nova
Porém, em função do Fe encontrar-se, na maior parte do tempo,
ligado a proteínas de transporte ou armazenamento, em situação
normal, as propriedades antioxidantes do ascorbato suplantam
suas propriedades pró-oxidantes24. O ascorbato pode atuar
contra a peroxidação de lipídios de duas maneiras: no plasma
sanguíneo, atua na prevenção através da reação com as ERO e
ERN presentes, ou na restauração doando hidrogênio ao radical
lipídio (80). Isso explica seu papel na prevenção de doenças
cardiovasculares, devido ao fato de que sem a formação dos radicais
lipídio-peroxila (81) não ocorre o ataque às proteínas das
paredes dos vasos e artérias sanguíneos, causando o acúmulo de
lipídios nessas paredes e, conseqüentemente, seu entupimento.
Por outro lado, nas membranas celulares ele atua em parceria
com o α-tocoferol (82). O radical livre normalmente abstrai um
próton do carbono metilênico alílico, e o radical lipídio formado
(80) rapidamente adiciona oxigênio tripleto gerando o radical
lipídio-peroxila (81). Nesta etapa, o tocoferol (82) age doando
um hidrogênio para esse radical formando o lipídio-hidroperóxido
(83) e o radical tocoferoxila (84). O ascorbato (75) na
interface da membrana celular regenera o tocoferol doando um
hidrogênio, transformando-se em semidesidroascorbato (76) (Figura
6). As enzimas fosfolipase A2, fosfolipídio hidroperóxido
glutationa peroxidase, GPx e ácido graxo coenzima A restauram
o lipídio25.
O papel do ascorbato na proteção à oxidação do DNA e, conseqüentemente,
sua ação preventiva no câncer é ambíguo. Estudos
indicam que o consumo de ascorbato inferior ao recomendado (40-
60 mg/dia), por ex., consumo de 5 mg/dia aumentou os níveis de
8OHdG (5) em 91%. O consumo de 60 mg/dia reduziu os níveis de
8OHdG e 8OHG (8) no organismo reduzindo-se, assim, o risco
de câncer. Foi verificado que uma suplementação superior a
500 mg/dia de ascorbato fez com que os níveis de 8OHdG e 8OHG
decrescessem ainda mais, porém ocorrendo aumento nos níveis de
8OHA (9), Fapy-A (7) e Fapy-G (6). Mesmo com o aumento dessas
espécies, o processo pode ser considerado benéfico, pois o
8OHdG e o 8OHG têm maior poder mutagênico que 8OHA, Fapy-
A e Fapy-G. Não está estabelecido se a queda nos níveis de 8OHdG
e 8OHG é conseqüência direta da ação do ascorbato como
antioxidante ou da sua atuação como cofator das enzimas de reparo.
Além disso, os níveis de 8OHA, Fapy-A e Fapy-G só aumentam
expressivamente quando a concentração de ascorbato no plasma
sanguíneo está acima de 70 μM. Como a ingestão de 100 mg/dia
promovia uma concentração de 60 μM no plasma, recomendou-se
uma ingestão entre 100-200 mg/dia, para otimizar suas propriedades
antioxidantes sem causar danos ao DNA24.
A vitamina E no ciclo oxidativo
A vitamina E é constituída principalmente por quatro tocoferóis,
e secundariamente por quatro tocotrienóis, sendo o α-tocoferol (82)
o mais ativo26. Estudos comprovam que a vitamina E é um eficiente
inibidor da peroxidação de lipídios in vivo. Estas substâncias
agem como doadores de H para o radical peroxila, interrompendo
a reação radicalar em cadeia. Cada tocoferol pode reagir com até
dois radicais peroxila e, nesse caso, o tocoferol é irreversivelmente
desativado. Para que eles não se desativem, necessitam do mecanismo
de regeneração sinergético com o ascorbato nas membranas
celulares e com a ubiquinona na membrana mitocondrial25,27 (Figura
6).
A reação de doação do H radicalar fenólico para os radicais
peroxila é acelerada pela presença de um grupo metoxi em para,
pois este estabiliza o radical formado por ressonância, e grupos metila
em orto ou em orto e meta que apresentam pequeno impedimento
estérico. Ao mesmo tempo, essa reação é retardada quando a hidroxila
fenólica se encontra estericamente impedida por grupos alquila maiores
em orto, ou quando em presença de um grupo retirador de elétrons
em para. Deste modo, não é possível prever qual dos tocoferóis
tem maior atividade. No entanto, estudos cinéticos realizados in vitro
Figura 5. Ciclo oxidativo do ascorbato
Figura 6. Ataque à membrana celular e proteção pelo tocoferol e ascorbato. Esquema baseado na ref. 25
Vol. 29, No. 1 Estresse Oxidativo: Relação entre Geração de Espécies Reativas 119
demonstram que o α-tocoferol possui uma constante de velocidade
grande (k= 235 ± 50 M-1 s-1) para a transferência do H• para um radical
peroxila. Essa constante é maior que para a maioria dos
antioxidantes sintéticos e ligeiramente superior aos outros tocoferóis:
β-tocoferol (k= 166 ± 33 M-1 s-1), γ-tocoferol (k= 159 ± 42 M-1 s-1) e
δ-tocoferol (k= 65 ± 13 M-1 s-1). Esses resultados estão em acordo
com o observado em testes in vivo28.
As observações do efeito cinético em α-tocoferol com a hidroxila
fenólica marcada com deutério confirmam que a reatividade reside na
porção fenólica da molécula. Com base nessa observação foram avaliadas
as constantes de velocidade de doação do H para o 2,3,5,6-
tetrametil-4-metoxifenol (TMMP) (85) e o 2,2,5,7,8-pentametil-6-
hidroxicromano (PMHC) (86). Observa-se que a constante de velocidade
para o TMMP (k= 21 ± 2 M-1 s-1) representa apenas 9% da atividade
do a-tocoferol, enquanto que para o PMHC (k= 214 ± 81 M-1 s-1)
é aproximadamente idêntica à atividade do α-tocoferol. Esta aparente
incoerência pode ser explicada por efeitos estéricos. A presença do
grupo metoxi em para nos fenóis (87) aumenta a velocidade de doação
do H radicalar. Isso é devido ao fato que o elétron não ligante do
oxigênio metoxílico pode se deslocalizar migrando para o oxigênio
do radical fenóxido (88) formando o íon fenolato, que é estabilizado
por sua deslocalização com o anel aromático. O radical TMMP não
apresenta esse aumento de velocidade na doação do H•, devido ao
impedimento estérico dos grupos metila. Esses grupos promovem o
deslocamento da metoxila por efeito estérico para fora do plano do
anel aromático, de modo que o orbital p com o seu par de elétrons
fique no plano do anel aromático, inviabilizando a migração do elétron.
Com o PMHC e os tocoferóis ocorre o aumento da velocidade
de doação do H•. Esse fato é explicado pela presença de um segundo
anel com o oxigênio, que impede o giro do grupo e mantém o orbital
p perpendicular ao anel aromático. Assim, torna-se possível a migração
do elétron não ligante do oxigênio do anel para o orbital
semipreenchido do oxigênio radicalar (89). Embora o α-tocoferol e o
PMHC apresentem atividades semelhantes in vitro, o PMHC apresenta
pouca ou nenhuma atividade in vivo. Esse fato é explicado pela
cadeia carbônica lateral dos tocoferóis que aumenta sua solubilidade
nas biomembranas, sítio onde eles atuam28.
Com base em observações estruturais é de se esperar que os
tocotrienóis apresentem atividade semelhante à dos tocoferóis perante
as ERO e ERN. Porém a atividade do α-tocotrienol contra a
peroxidação de lipídios é maior que a do α-tocoferol, assim como
a atividade dos tocotrienóis é maior que a dos respectivos tocoferóis.
Essa diferença de atividade é justificada por uma distribuição mais
uniforme na bicamada lipídica das membranas, que leva à interação
mais eficiente do anel cromano com os radicais lipídicos e à maior
eficiência na reciclagem do radical cromanoxila26.
O papel dos carotenóides e da vitamina A no ciclo oxidativo
Dentre os carotenóides, o β-caroteno é a mais importante fonte
de vitamina A29. Eles formam um tipo incomum de agentes redutores
biológicos, pois reduzem melhor os produtos de oxidação a
baixos níveis de oxigênio. Altos níveis de oxigênio levam à destruição
dos carotenóides. Na maioria dos tecidos biológicos, o nível
de oxigênio é baixo, de modo que os carotenóides adquirem
importância como antioxidantes. Os carotenóides agem in vivo
como desativadores do oxigênio singleto ou como seqüestradores
dos radicais peroxila, reduzindo a oxidação do DNA e lipídios, que
está associada a doenças degenerativas, como câncer e doenças
cardíacas29.
A principal atividade antioxidante dos carotenóides é a desativação
do oxigênio singleto, sendo que a velocidade para essa reação
é superior à dos tocoferóis. A desativação do 1O2 pode se dar de
duas formas, pela transferência física da energia de excitação do
1O2 para o carotenóide e pela reação química do carotenóide com o
1O2. Em condições normais no organismo, 95% da desativação do
1O2 é física, restando somente 5% para reagir quimicamente, o que
torna os carotenóides antioxidantes mais efetivos. Os produtos destas
reações são apresentados na Figura 8 29,30.
Uma outra atividade recentemente estudada é do seqüestro de
radicais peroxila. Os radicais peroxila adicionam-se à dupla ligação
5-6, 5’-6’ ou 15-15’ da cadeia do caroteno. Estudos de mecanismo
revelaram a preferência pela adição em 5,6 ou 5’,6’, geran-
Figura 7. Representação das estruturas dos radicais 4-metoxifenoxil, TMMP
e PMHC com os orbitais dos átomos de oxigênio. Reproduzido da ref. 28,
com permissão da American Chemical Society
Figura 8. Principais produtos do ciclo oxidativo do β-caroteno
120 Barreiros et al. Quim. Nova
do o radical altamente estabilizado por ressonância (93). Esse radical
sofre, então, uma substituição homolítica intramolecular, originando
os éteres cíclicos (91 e 92), interconversíveis em meio
ácido, além do radical alcoxila30 (Figura 8).
O processo completo de oxidação dos carotenóides pode ser
dividido em duas etapas. Na primeira, ocorre a formação de éteres
cíclicos e compostos carbonílicos. Na segunda etapa os produtos
primários são convertidos em compostos carbonílicos de cadeias
menores, com liberação de CO2 e ácidos carboxílicos. O processo
completo é descrito por Woodall et al.30,31. Os mecanismos propostos
esclarecem a atividade dos carotenóides frente ao oxigênio
singleto e aos radicais peroxila, porém não esclarecem a atividade
contra outros radicais e se esses são capazes de interromper a reação
radicalar em cadeia. Observa-se também a menor atividade
antioxidante para os carotenóides que possuem substituição em 4
e/ou 4’, em relação aos outros. Essas observações podem ser
explicadas pela presença de carbonos metilênico em 4 e 4’ vizinhos
às insaturações conjugadas, que doam um hidrogênio para os
radicais livres, devido ao fato do radical gerado ser extremamente
estabilizado por ressonância (94)31.
Outro aspecto da atividade dos carotenóides diz respeito à polaridade.
Aqueles que possuem grupos polares nos anéis A e B são
efetivos na prevenção da oxidação das membranas. Essa polaridade
os localiza de maneira tal que estão em contato mais próximo
com a fase aquosa, reagindo com os radicais que penetram a membrana.
Os apolares, tais como o licopeno e o β-caroteno são mais
regeneradores que preventivos, combatendo os radicais formados
com mais eficiência no interior da membrana31. Os retinóides (vitamina
A) possuem grupos polares que os localizam na membrana
celular na região próxima à fase aquosa. No entanto, eles apresentam
atividade antioxidante cerca de cinco vezes menor que a do β-
caroteno sendo, provavelmente, a menor extensão da conjugação29,31.
Coenzima Q10 no ciclo oxidativo
A coenzima Q10 é uma ubiquinona lipossolúvel que possui uma
cadeia longa isoprenóide lateral. A ubiquinona é o único lipídio
endogenamente sintetizado que apresenta função redox32. Embora
de forma diferenciada e bem específica essa é biossintetizada por
todas as células, o que a torna o maior constituinte da membrana
mitocondrial interna, membrana do complexo de Golgi e membrana
dos lisossomos. Por outro lado, apenas poucas moléculas são
encontradas na membrana do LDL. Essa variação na distribuição
sugere funções diferentes para diferentes membranas biológicas.
A ubiquinona ingerida como suplemento alimentar distribui-se principalmente
entre o fígado e o plasma sanguíneo, não sendo absorvida
pelas membranas com concentração elevada desta substância.
Nos humanos, sua biossíntese é muito ativa até os 30 anos de idade,
época que ocorre a estagnação de sua produção e, a partir desta
idade, os níveis de ubiquinona começam a decrescer. Estudos indicam
que a administração de suplementos de ubiquinona possui efeito
benéfico no tratamento de doenças do coração, degeneração muscular
e outras doenças degenerativas33. Sua forma reduzida
ubiquinol-10 (CoQH2) é uma hidroquinona que ocorre predominantemente
no coração, rins e fígado e a forma oxidada ubiquinona
(CoQ10) é abundante no cérebro e no intestino34. A principal função
da ubiquinona acontece na membrana mitocondrial interna, onde
participa da cadeia de transporte de elétrons e translocação de
prótons H+ na mitocôndria, juntamente com os citocromos e as
desidrogenases mitocondriais. As desidrogenases oxidam os NADH,
NADPH e FADH2 e transferem prótons e elétrons para a ubiquinona,
convertendo-a em ubiquinol. Este por sua vez transfere prótons
para a matriz mitocondrial e elétrons para os citocromos. Dessa
forma, citocromos reduzem o O2 para H2O com esses elétrons e
prótons da matriz. Todo esse processo é indispensável para produção
de ATP33.
O ciclo redox da ubiquinona, porém, também é capaz de transferir
elétrons desemparelhados para aceptores que não participam
da cadeia respiratória. A oxidação do ubiquinol dá-se pela doação
de hidrogênio para um radical livre, gerando a respectiva
semiquinona. O prosseguimento da oxidação leva à formação da
ubiquinona com a desativação final de dois radicais livres. Dessa
maneira, essa substância possui grande poder antioxidante através
do seqüestro de radicais livres, bem como se mostra eficiente na
interrupção de reações radicalares em cadeia. Tal atividade está
limitada ao meio lipossolúvel, devido a sua longa cadeia lateral16,33.
Outra importante função da ubiquinona é a regeneração do
tocoferol na membrana mitocondrial, onde exerce a mesma função
regenerativa que o ascorbato exerce na membrana celular. O
ubiquinol (101) doa um hidrogênio radicalar para o radical tocoferil
(84), gerando ubiquinona semiquinona (102) e α-tocoferol (82). O
prosseguimento dessa reação gera ubiquinona e regenera mais uma
molécula de α-tocoferol25,27,35 (Figura 9).
A ubiquinona também exerce papel considerável na desativação
do radical ânion superóxido, pois este após ser gerado na
mitocôndria é prontamente oxidado pela ubiquinona formando
oxigênio e a forma reduzida ubiquinol18,19. A cadeia lateral da
ubiquinona e ubiquinol também exerce função importante na atividade
desses, uma vez que suas insaturações participam na
desativação do oxigênio singleto 1O2, tanto por desativação física
colisional quanto por adição às insaturações16. Uma última atividade
relevante da ubiquinona na mitocôndria é a redução do nitrito
(NO2
-) a óxido nítrico (NO), que é um agente bioregulador33.
Toda essa atividade antioxidante está favorecida na mitocôndria
devido à estabilização do radical livre intermediário (102) pelos
seus pares redox, através do fluxo de elétrons da cadeia respiratória.
Em pH = 6,0 da mitocôndria esse radical encontra-se predominantemente
na forma desprotonada. Nesse estado, sem a presença
de seus pares redox ele se desestabiliza em presença de oxigênio,
gerando ubiquinona e radical ânion superóxido O2
•−. Porém, em
situações de acúmulo de NADH e/ou NADPH, tal como na isquemia,
ou em outras membranas que não possuem tal estabilização, o
acúmulo da forma desprotonada aumenta a reação de formação do
radical ânion superóxido. Como o ubiquinol possui atividade análoga
à SOD, o superóxido é dismutado gerando H2O2. O contato da
ubiquinona semiquinona desprotonada com o peróxido de hidrogênio
ou o radical peroxila é desastroso, gerando radicais hidroxila
(HO•) e alcoxila (RO•), respectivamente.
Na membrana dos lisossomos a atividade apresentada pela
Figura 9. Regeneração do tocoferol pelo ubiquinol
Vol. 29, No. 1 Estresse Oxidativo: Relação entre Geração de Espécies Reativas 121
ubiquinona é diferente. Esta membrana é muito rica em ubiquinona,
com a peculiaridade de que a espécie dominante é a CoQ9, que se
encontra 70% na forma reduzida desprotonada. Sua função é o transporte
de H+ para o interior do lisossomo, além de ter uma função
prooxidante. Nesse caso, a geração de radicais livres auxilia na
função do lisossomo33,34. Nas outras membranas e no plasma, o
papel da ubiquinona é fundamentalmente de antioxidante. Como
não há a presença dos pares redox da mitocôndria para estabilizar
as ubiquinonas semiquinonas, elas são controladas por desproporcionamento
onde duas moléculas de semiquinonas geram uma
molécula de ubiquinol e uma de ubiquinona. Outra forma de eliminação
do excesso de semiquinonas é sua regeneração pelo ascorbato,
gerando ubiquinol e semidesidroascorbato. Os efeitos deletérios
das semiquinonas são eliminados em condições normais. Isso favorece
os efeitos benéficos da ubiquinona, tornando-a útil como
antioxidante para o organismo33,34.
Ácido úrico no ciclo oxidativo
O ácido úrico é a principal forma de excreção de nitrogênio
das aves e dos répteis. Nos mamíferos, é produto secundário de
excreção, derivado das bases purínicas. Na maioria dos tecidos orgânicos
encontra-se na forma de ânion urato (pKa1=5,4). Somente
a partir dos anos 80 foi demonstrado que é um antioxidante efetivo
nos sistemas biológicos, capaz de proteger o DNA e lipídios de
ERO e ERN. A alta polaridade do ácido úrico restringe sua atividade
ao meio aquoso. A sua concentração nos compartimentos aquosos
do organismo encontra-se muito próxima do limite de solubilidade
(300 μM). Indivíduos com aterosclerose podem apresentar
nível elevado de ácido úrico no sangue, que é indicativo da existência
de um mecanismo compensatório encontrado pelo organismo
para controlar o estresse oxidativo16,36.
O mecanismo antioxidante do urato (103) pode ser resumido
pela reação com a maioria dos agentes oxidantes em velocidade
superior a das outras purinas (Figura 10). Nessa reação, há formação
do radical urato (104) estabilizado. Devido ao baixo pKa=3,1
do radical urato, esse se encontra na forma de ânion radical urato
(105), o que facilita a doação de um próton em conjunto com o
elétron. O pKa de segunda ionização de 9,5 não permite que o
radical urato se encontre na forma de um diânion no organismo36.
O urato reage rapidamente com o radical hidroxila HO•, no
entanto, o urato é inerte às espécies superóxido (HOO–), radical
ânion superóxido (O2
• –), peróxidos (ROOH) e peróxido de hidrogênio
(H2O2). Sozinho não é capaz de desativar o oxigênio singleto
1O2, porém no meio biológico ele causa indiretamente sua desativação
através da desativação de outras espécies excitadas. Sua
reação mais importante é com os radicais peroxila (ROO•) e NO2
•
(gerando NO2
–). Essa grande atividade contra os radicais peroxila
é a base do seu efeito antioxidante protetor do DNA e lipídios.
Como ocorre em meio aquoso, o urato reage com os radicais peroxila
antes desses penetrarem a membrana e iniciarem seus danos.
O urato é capaz de recuperar estruturas já atacadas que se tornaram
radicais livres através da doação de um elétron e um próton.
Ele também é responsável pela estabilização do ascorbato no plasma
sanguíneo, inibindo a reação de Fenton16,36 através de sua capacidade
de quelar íons metálicos como Fe+3, Fe+2, Cu+2 e Cu+ (106 e
107) (Figura 10).
O ânion radical urato pode ser regenerado a urato pelo ascorbato,
gerando semidesidroascorbato. Porém, o urato não é capaz de regenerar
a vitamina E. A decomposição oxidativa irreversível do
urato leva à formação inicialmente da alantoína (108) e prossegue
gerando o ácido alantoínico (109), ácido cianúrico, ácido
parabânico, ácido oxálico e ácido glioxílico36.
O papel da hemoglobina no ciclo oxidativo
A degradação da hemoglobina libera o grupo heme no organismo.
A ferroporfirina ou grupo heme da hemoglobina é liberada no
baço, originária das células vermelhas mortas. A sua degradação
libera Fe+3 e produz a biliverdina, um intermediário tetrapirrolico
linear, que é reduzido pelo NADPH sob ação da enzima biliverdina
redutase a bilirrubina, que pode se apresentar na forma lactâmina
ou lactímica. O heme não é diretamente transportado pelo sangue
devido à sua atividade prooxidante. Devido ao Fe central, esse é
capaz de reagir com peróxidos ROOH ou H2O2 originando vários
radicais livres (Equações 24-28).
ROOH + Heme-Fe+3 ROO• + Heme-Fe+2 + H+ (24)
ROOH + Heme-Fe+2 RO• + Heme-Fe+3 + HO• – (25)
———————————————————————
2ROOH ROO• + RO• + H2O (26)
RSH + Heme-Fe+3 RS• + Heme-Fe+2 + H+ (27)
Heme-Fe+2 + O2 Heme-Fe+3 + O2
• – (28)
Tanto a biliverdina quanto a bilirrubina possuem propriedades
pró e antioxidantes, além de propriedades tóxicas in vitro e in vivo.
O aumento da biliverdina é detectado em indivíduos com necrose
hepática e pode ampliar a atividade de certos oncogenes do fígado,
ocasionando câncer. No entanto, em condições normais a atividade
antioxidante da bilirrubina suplanta sua atividade prooxidante38.
A atividade antioxidante da bilirrubina ocorre principalmente
quando se encontra ligada à albumina sérica, sendo esse complexo
considerado um dos antioxidantes naturais dos fluidos extracelulares.
Essa atividade acontece principalmente devido à sua grande
reatividade com radicais peroxila (ROO•). No entanto, ela também
reage com radicais superóxido a 1/10 da velocidade do
ascorbato. A reação da bilirrubina com o oxigênio singleto é variável,
podendo ser tanto um gerador a partir do oxigênio tripleto,
quanto um desativador físico efetivo. Por último, essa exerce o papel
de regeneradora do α-tocoferol, embora com menor importância
que outros regeneradores, tais como o ascorbato (75) e a CoQ10
(101)16,38.
Figura 10. Sumário das reações envolvendo a atividade antioxidante do ácido
úrico
122 Barreiros et al. Quim. Nova
Flavonóides como antioxidantes
De modo geral, os polifenóis e em particular os flavonóides
possuem estrutura ideal para o seqüestro de radicais, sendo
antioxidantes mais efetivos que as vitaminas C e E. A atividade
antioxidante dos flavonóides depende da sua estrutura e pode ser
determinada por cinco fatores: reatividade como agente doador de
H e elétrons, estabilidade do radical flavanoil formado, reatividade
frente a outros antioxidantes, capacidade de quelar metais de transição
e solubilidade e interação com as membranas.
A atividade de seqüestro está diretamente ligada ao potencial
de oxidação dos flavonóides e das espécies a serem seqüestradas.
Quanto menor o potencial de oxidação do flavonóide, maior é
sua atividade como seqüestrador de radicais livres. Flavonóides
com potencial de oxidação menor que o do Fe+3 e Cu+2 e seus
complexos podem reduzir esses metais, sendo potencialmente
prooxidantes, tendo em vista que o Fe+2 e o Cu+ participam da
reação de Fenton geradora de radicais livres39. Quanto maior o
número de hidroxilas, maior a atividade como agente doador de
H e de elétrons40. Flavonóides monoidroxilados apresentam atividade
muito baixa, por ex. a 5-hidroxi-flavona tem atividade abaixo
dos limites de detecção. Flavonas possuindo apenas uma
hidroxila em 3, 6, 3’ ou 4’, assim como flavanonas apresentando
apenas uma hidroxila em 2’-OH, 3’-OH, 4’-OH, 6-OH também
mostram fraca atividade. A 7-hidroxi-flavanona representa uma
exceção, que pode ser justificada pela tendência maior da 7-OH
em doar H• devido à estabilização do radical formado por
deslocalização com a carbonila em C-4 (110 e 111) (Figura 11).
Entretanto, apesar dessa exceção, para proteger os lisossomos e
outras membranas contra o estresse oxidativo foi constatada a
necessidade de no mínimo duas hidroxilas fenólicas no flavonóide,
demonstrando que os monoidroxiflavonóides não são efetivos.
Entre os flavonóides diidroxilados, destacam-se aqueles que possuem
o sistema catecol (3’,4’-diidroxi) no anel B. Os flavonóides
com múltiplas hidroxilas como a miricetina (118), quecertina
(117), luteolina (119), fustina (120), eriodictiol (121) e taxifolina
(122) possuem forte atividade antioxidante quando comparados
ao α-tocoferol, ácido ascórbico, β-caroteno, glutationa, ácido úrico
e bilirrubina40,41 (Figura 11).
A estabilidade do radical livre flavanoil formado depende da
habilidade do flavonóide em deslocalizar o elétron desemparelhado.
A presença de hidroxilas em orto é o principal fator que auxilia
nessa deslocalização. Os outros fatores são a presença de insaturação
no anel C e hidroxila em C-4’ em B conjugada com a carbonila;
ângulo do anel B do flavonóide e do radical formado em relação ao
restante da estrutura, sendo que esse ângulo é regulado pela presença
ou ausência de hidroxila em C-3; presença de duas
insaturações em C; conjugação da carbonila em C-4 com hidroxila
em C-5 e, presença de hidroxila em C-7 42. A doação do H• ocorre
principalmente nas posições 7-OH > 4’-OH > 5-OH, seguindo a
seqüência das constantes de dissociação42. Os flavonóides, devido
ao seu caráter fracamente ácido encontram-se, em geral, parcialmente
ionizados, o que aumenta a estabilidade na posição C-4’ e
favorece a deslocalização do elétron desemparelhado do radical
formado entre os anéis A, B e C [por ex., quercetina parcialmente
ionizada em C-4’ (112)]. A doação do H radicalar para o radical
livre ocorre principalmente nas posições C-4’ (113) e C-7 (114).
Ambos os radicais livres formados podem ter seu elétron
deslocalizado pela estrutura, com maior estabilidade para os radicais
113, 115 e 116, devido à estabilização resultante das ligações
de hidrogênio4,42,43.
A remoção de metais de transição livres no meio biológico é
fundamental para a proteção antioxidante do organismo, visto que
esses catalisam as reações de Fenton (Equação 3) e de Haber-
Weiss (Equação 15). Para a atividade de quelação de metais de
transição é fundamental a presença de grupos orto-difenólicos,
onde o mais comum é o sistema 3’,4’-diidroxi, unidade catecol
em B e/ou estruturas cetol como 4-ceto-3-hidroxi e 4-ceto-5-
hidroxi. A substituição de qualquer uma das hidroxilas envolvidas
na quelação de metais reduz essa atividade devido, principalmente,
ao impedimento estérico provocado. Outros sistemas ortodifenólicos
em flavonóides menos comuns também podem quelar
os metais de transição, como por ex. o 6,7-diidroxi ou 7,8-
diidroxi4,39,43.
O último fator importante que influencia a atividade antioxidante
dos flavonóides é a sua interação com as biomembranas. A
lipofilicidade do flavonóide indica a incorporação desse pela membrana,
que é alvo da maioria das ERO e ERN. Assim, deve haver
uma concentração mínima do flavonóide por ácido graxo, de modo
a assegurar a presença de uma de suas moléculas próxima ao sítio
de ataque do radical44. Flavonóides que possuem uma cadeia de
açúcares ligada em sua estrutura são muito polares, não sendo assimilados
pela membrana, porém, nesta forma eles podem ser armazenados
em vesículas, possuindo um tempo maior de permanência
no organismo. Os flavonóides que são assimilados pelas
membranas exercem a função de moduladores de fluidez. Restringindo
essa fluidez os flavonóides geram um impedimento físico
para a difusão das ERO e ERN, de modo que decresce a cinética
das reações responsáveis pelo estresse oxidativo. Esse tipo de atividade
antioxidante é similar ao relatado para o α-tocoferol e o
colesterol45.
Figura 11. Flavonóides antioxidantes e mecanismo da estabilização elétron
desemparelhado
Vol. 29, No. 1 Estresse Oxidativo: Relação entre Geração de Espécies Reativas 123
CONSIDERAÇÕES FINAIS
O organismo humano está sujeito ao estresse oxidativo causado
por ERO e ERN provenientes do meio ambiente ou geradas
pelo próprio organismo. Entre as biomoléculas alvo dessas espécies
encontram-se as que compõem membranas celulares, proteínas
DNA e RNA. Hoje em dia sabe-se que a ação de espécies oxidantes
sobre o DNA é responsável por mutação ou mesmo oncogênese.
No entanto, o organismo é protegido em parte por macro e micromoléculas
de origem endógenea ou obtidas diretamente da dieta. A
proteção enzimática baseia-se quase que exclusivamente na decomposição
de ânion superóxido ou dismutação de peróxido de hidrogênio,
agentes oxidantes brandos. Cabe às micromoléculas, tais
como tocoferóis, carotenóides e flavonóides entre outros, o papel
de impedir o ataque de ERO e ERN ou regenerar os danos causados
em sistemas biológicos essenciais. O mecanismo complexo de
atividade anti e pró-oxidante destas substâncias é alvo de extensos
estudos científicos contemporâneos, tendo em vista que o sucesso
destas investigações está diretamente relacionado com a melhoria
da qualidade de vida do ser humano.
AGRADECIMENTOS
Ao CNPq, à FAPESB e ao IMSEAR pelas bolsas e auxílios.
LISTA DE ABREVIATURAS
8OHdA – 5’-8-ciclo-2’-desoxiadenosina
8OHdG – 5’-8-ciclo-2’-desoxiguanosina
8-oxoA – 8-oxo-7,8-diidro-2’-desoxiadenosídeo
8-oxoG – 8-oxo-7,8-diidro-2’-desoxiguanosídeo
AG-CoA – Ácido graxo coenzima A
CAT - Catalase
ERN – Espécies Reativas de Nitrogênio
ERO – Espécies Reativas de Oxigênio
FapyA – 4,6-diamino-5-formamido-pirimidina
FapyG – 2,6-diamino-4-hidroxi-5-formamidopirimidina
GPx – Se-glutationa peroxidase
GR – Glutationa Redutase
GSH – Glutationa
HPODE – Ácido hidroperoxioctadecadienóico
PMHC – 2,2,5,7,8-pentametil-6-hidroxicromano
SHi – Substituição Homolítica Intramolecular
SOD – Superóxido dismutase
TMMP – 2,3,5,6-tetrametil-4-metoxifenol
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