RESUMO O óxido nítrico é um mediador gasoso responsável por uma variedade de fenômenos
fisiológicos. A l-arginina é a precursora da síntese do óxido nítrico, na presença de óxido nítricosintase.
Este artigo revê as funções das óxido nítrico-sintases e como o óxido nítrico atua na
permeabilidade vascular e na síndrome de isquemia e reperfusão, assim como possíveis métodos
para sua mensuração.
INTRODUÇÃO
Em 1980, FURCHOGOTT E ZAWADZKI
demonstraram que o relaxamento vascular induzido por
acetilcolina foi dependente da presença do endotélio e
evidenciaram que este efeito foi mediado por um fator
humoral lábil, mais tarde conhecido como fator de
relaxamento dependente do endotélio (EDRF).
Em 1987 foi demonstrado que esse fator de
relaxamento derivado do endotélio era um radical livre,
o óxido nítrico (NO). PALMER e col. (1987) sugeriram
que EDRF e óxido nítrico eram indistinguíveis na
atividade biológica, estabilidade química e
susceptibilidade à inibidores ou potencialização e que
ambos tinham sua ação inibida pela hemoglobina e
potencializada por superóxido dismutase. Porém, alguns
autores alegaram que a forma ativa do EDRF não era o
NO, mas um precursor do NO ou um tiol derivado do
NO3. O óxido nítrico foi escolhido como a molécula
do ano de 1992.
O óxido nítrico pode ser um oxidante ou um
redutor dependendo do meio em que ele está e é
rapidamente destruído pelo oxigênio, sendo que sua
oxidação produz nitrito e nitrato. O NO tem o menor
peso molecular de qualquer produto de secreção celular
de mamíferos; sua meia-vida é curta e a especificidade
de suas reações é mínima. O NO é citotóxico e
vasodilatador e modula reações inflamatórias ou
antiinflamatórias, dependendo do tipo celular e do
estímulo.
A molécula do NO tem um elétron não pareado e
reage facilmente com oxigênio, radical superóxido, ou
metais de transição, como ferro, cobalto, manganês
ou cobre. O NO tem alta afinidade com o heme,
encontrado em proteínas intracelulares (óxido nítricosintase,
cicloxigenase e guanilato ciclase) e também
liga-se a grupos -SH, formando tiol; é um gás incolor
e estável, moderadamente solúvel em água e sua meiavida
varia de 3 a 60 segundos, mas pode ser maior
devido ao ambiente do NO, concentração de O2 e O.
Parece que o NO exerce maior efeito na imunidade
inespecífica do que na específica, exibindo atividade
citostática ou citocida contra uma notável amplitude
de microorganismos patogênicos.
PRODUÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO
Várias células utilizam a arginina para sintetizar o
óxido nítrico. Nas células do endotélio vascular, na
presença de oxigênio molecular, o terminal guanidino
nitrogenado da L-arginina produz o radical livre gasoso,
NO, e L-citrulina em um processo catalisado pela enzima
óxido nítrico-sintase.
O NO atravessa o espaço do endotélio para o
músculo liso vascular e estimula diretamente a enzima
guanilato ciclase solúvel e a conseqüente formação de
cGMP (monofosfato cíclico de guanosina) intracelular,
resultando no relaxamento das células da musculatura
lisa vascular.
Quando o cGMP está alto, o cálcio intracelular
aumenta, relaxando a células e a vasodilatação se desenvolve.
A vasodilatação se mantém enquanto a difusão
do NO para a musculatura lisa vascular estiver ocorrendo.
Um aumento no fluxo de NO para a musculatura
lisa vascular provoca maior relaxamento celular e maior
vasodilatação. Se a formação de NO diminui, ocorre
uma vasoconstrição moderada. O efeito vasodilatador
do NO parece ser mantido por estímulos físicos do
fluxo pulsátil e força de cisalhamento nas células
endoteliais vasculares.
O NO também pode ser produzido pelas células
musculares lisas, podendo regular a atividade dessas
células por um mecanismo dependente da GMPc.
A interação do NO com a guanilil ciclase solúvel
provoca muitos efeitos fisiológicos e patofisiológicos.
Entretanto, o NO ou os produtos de sua reação com
oxigênio molecular e radicais superóxido podem modificar
diferentes macromoléculas como proteínas, lipí-
dios e ácidos nucléicos para produzir tanto efeitos
fisiológicos como patofisiológicos . O NO também pode
reagir diretamente com metais de transição.
FUNÇÕES DO ÓXIDO NÍTRICO
O NO medeia vários fenômenos, como vasorrelaxamento
dependente do endotélio, citotoxicidade
mediada por macrófagos, inibição da ativação, adesão
e agregação plaquetária, relaxamento do corpo cavernoso
peniano humano, regulação da pressão sangüínea
basal, depressão sináptica a longo prazo, potencialização
da transmissão sináptica a longo prazo, microcirculação
medular e glomerular e prevenção de piloroespasmo
em estenose pilórica hipertrófica infantil. A atividade
do NO foi relatada em endotélio, cerebelo, nervos não
adrenérgicos não colinérgicos (NANC), macrófagos,
neutrófilos, rins, células epiteliais pulmonares, mucosa
gastrintestinal e miocárdio. O NO também pode
ser responsável pela vasodilatação presente na
angiogênese fisiológica ou patológica, como no caso
de tumores.
No cérebro, o NO participa do aprendizado e da
memória e pode mediar respostas excitatórias a certos
aminoácidos. No trato gastrointestinal, o NO medeia o
relaxamento não adrenérgico não colinérgico da musculatura
longitudinal e circular do esfíncter esofagiano,
estômago, duodeno, intestino delgado e esfíncter anal
interno.
No sistema respiratório, os nervos NANC da musculatura
lisa bronquiolar liberam o NO como mediador
do controle neurogênico da broncodilatação. No sistema
reprodutor, o NO controla o relaxamento da musculatura
lisa do corpo cavernoso peniano e seus vasos sang
üíneos aferentes. Esse relaxamento muscular e vascular
leva à tumescência vascular necessária à ereção.
No sistema circulatório, em particular na coagula-
ção sangüínea, o NO está envolvido com a cascata
fibrinolítica e trombótica associados com dano endotelial,
sendo que as propriedades antitrombóticas do NO
resultam em parte da inibição da adesão e agregação
plaquetária. A deficiência de NO foi associada com
trombose arterial.
Nos vasos sangüíneos, o NO exerce função na
modulação do diâmetro vascular e da resistência vascular
pela sua habilidade em relaxar o músculo liso
vascular. O NO inibe interações de elementos sangüí-
neos circulatórios com a parede do vaso. Uma deficiên-
cia de NO pode promover trombose vascular, restenose,
aterogênese e injúria da reperfusão. A diminuição
da vasodilatação dependente do endotélio pode ser induzida
por hipertensão, diabetes e/ou aterosclerose. O
NO pode ser um inibidor da adesão leucocitária em
microvasos pós-capilares.
Artérias e arteríolas produzem mais NO do que
veias e vênulas, sendo que a vasodilatação provocada
pelo cisalhamento é maior em artérias do que em
arteríolas e vasos resistentes. Nas artérias, porém não
nas veias, há liberação contínua de NO, mantendo o
tônus dilatador.
Em condições fisiológicas, a formação de NO pode
estar acima dos níveis basais quando há aumento do
fluxo sangüíneo e o contato entre sangue e parede está
facilitado. O aumento no fluxo provoca relaxamento
nas células musculares lisas e dilatação do vaso. A
tendência das plaquetas em se aderir à parede vascular,
que poderia ser aumentada pelo cisalhamento, também
é neutralizada pela elevada formação de NO.
Resumidamente, em condições basais, em
indivíduos sadios, há tônus vasodilatador moderado e
constante, causado pelo NO endotelial se difundindo
para as células da musculatura lisa vascular; se a
formação basal de NO cessa, aparecerá vasoconstrição.
A baixa formação de NO (em várias doenças vasculares)
reduz a perfusão tecidual e promove a formação de
trombo, enquanto a alta formação de NO (patológico)
produz vasodilatação pronunciada e choque e com a
redução da atividade plaquetária a homeostase fica
prejudicada.
ÓXIDO NÍTRICO-SINTASE
A óxido nítrico-sintase (NOS) é a enzima respons
ável pela síntese do NO. Três isoformas de NOS são
descritas, sendo uma NOS induzida (iNOS) e duas NOS
constitutivas (cNOS).
As óxido nítrico-sintases estão presentes no citosol,
e são inibidas por análogos da L-arginina e requerem
NADPH, tetrahidrobiopterina (BH4), flavina adenina
dinucleotídeo (FAD), flavina mononucleotídeo (FMN)
e heme como cofatores.
A isoforma I ou óxido nítrico-sintase neuronal
(nNOS) é uma NOS constitutiva, presente em neurô-
nios, células epiteliais, SNC e SNPperiférico, sistema
NANC, mácula densa do rim, medula adrenal, músculo
esquelético, órgão sexual masculino, células b pancre
ática e outros. É cálcio-calmodulina dependente e
regula a transmissão sináptica no SNC; atua na regulação
central da pressão sangüínea, no relaxamento do
músculo liso e na vasodilatação via nervos periféricos.
Também regula o fluxo sangüíneo cerebral local e está
envolvida na formação da memória.
A isoforma II ou óxido nítrico-sintase induzida
(iNOS) é uma NOS induzida por citocinas e
lipopolissacarídeos, no endotélio e musculatura lisa
vascular. Não é regulada por cálcio. Produz grande
quantidade de NO que tem efeito citostático por inibição
de enzimas contendo ferro, também causando
fragmentação de DNA. Atua em parasitas e células
tumorais.
A isoforma III ou óxido nítrico-sintase endotelial
(eNOS) é uma NOS constitutiva e produz NO em
endotélio vascular sob condições basais, mas a força
de cisalhamento produzida pelo fluxo sangüíneo pode
incrementar sua produção. O NO liberado no lúmem
vascular é um potente inibidor de adesão e agregação
plaquetária na parede vascular e também inibe a adesão
de leucócitos ao endotélio vascular, inibe a síntese de
DNA, mitogênese e a proliferação de células da
musculatura lisa vascular e, também é responsável pela
regulação da pressão sangüínea e contratilidade do
músculo cardíaco. Sua expressão é restrita a células
endoteliais vasculares, embora existam relatos da sua
localização no hipocampo, sendo sua expressão em
humanos significantemente suprimida pela hipóxia.
O NO é sintetizado pela ativação da cNOS basal
(em células endoteliais vasculares e neurônios) segundos
a minutos após o aumento na concentração de cálcio
em resposta à ativação de receptores da superfície
celular e mecanismos de transdução de sinal. Sua
síntese não é afetada pela administração de glicocortic
óides. A cNOS apresenta forma monomérica,
é cálcio-calmodulina dependente e tem peso molecular
de 133 kd. É expressa continuamente na ausência de
agentes indutores, com síntese basal de concentração
picomolar.
Ao contrário, a iNOS não depende de cálcio para
ativação, mas a síntese de mRNA da iNOS é necessária
para sua atividade. A NOS induzida não é detectável
em condições basais. LPS ou endotoxinas bacterianas,
junto com citocinas, como TNFa, IL-1b ou IF-g,
induzem a síntese de iNOS, de 2 a 4 horas após a
exposição ao agente. A iNOS requer síntese protéica
para sua expressão e sua atividade persiste por mais de
24 horas. É encontrada sob forma de monômero e
tetrâmero com peso molecular de 130 kd13.
A indução de iNOS pode ser suprimida por TGBb,
IL-4, IL-10 sozinhos ou sinergicamente com macrófagos,
por IL-8 e por glicocorticóides, que inibem a
indução, mas não a atividade das enzimas já induzidas.
Segundo DAVIES e col. (1995), após a indução,
iNOS é ativa por 20 horas e sintetiza NO em
concentrações nanomolares, 1000 vezes maior que
cNOS. A indução da iNOS é responsável pelas
propriedades citotóxicas do NO.
O NO é formado na parede vascular tanto pela
cNOS como pela iNOS. A quantidade de NO produzida
pode determinar se ele é protetório ou tóxico. Embora
pequenas quantidades sejam necessárias para a
homeostasia, grandes quantidades, como aquelas
produzidas na ativação da iNOS são citotóxicas. Porém,
a produção de grandes quantidades de NO pode ser
importante na defesa contra invasores celulares,
tumores celulares e ainda em lesões vasculares com
perda endotelial.
A expressão da iNOS é o resultado de uma resposta
inflamatória localizada ou difusa resultante de uma
infecção ou dano tecidual. Assim, onde a resposta
inflamatória é parte de uma resposta adaptativa (isto é,
infecção ou sepse), a expressão de iNOS é benéfica;
quando a expressão da iNOS é parte da inflamação
anormal (não adaptativa), a expressão de iNOS pode
ser nociva (isto é, doença autoimune). Do lado benéfico,
a expressão da iNOS resulta em inibição do crescimento
de patógenos microbianos. A expressão de iNOS
também parece proteger tecidos de danos em resposta
inflamatória aguda sistêmica, também chamada de
sepse. A vasodilatação resultante da expressão de iNOS
em vasos sangüíneos maximiza a perfusão tecidual em
sepse, embora, se excessiva, a pressão sangüínea possa
tornar-se perigosamente baixa. A expressão de iNOS
em endotoxemia é citoprotetória, inibindo microtrombose
pela prevenção de adesão plaquetária e danos
mediados por radicais. Os efeitos benéficos da express
ão da iNOS podem ser vistos tanto em infecções
localizadas quanto em conseqüências sistêmicas da
infecção. O oposto tem sido relatado em respostas inflamat
órias crônicas localizadas. A síntese de NO dependente
de iNOS por macrófagos no espaço subendotelial
e o potencial para sua inibição por lipoproteínas de baixa
densidade podem ter um impacto na patogênese dos
vasos sangüíneos ateroscleróticos.
A inibição da atividade da iNOS durante sepse pode
aumentar a pressão arterial, mas a inibição da cNOS
endotelial pode acentuar a agregação plaquetária e
aderência de leucócitos ao endotélio resultando em
trombose e dano a tecido normal.
ÓXIDO NÍTRICO E PERMEABILIDADE
VASCULAR
A inibição do NO endógeno pode provocar
aumento da permeablidade vascular, entretanto, a
administração exógena de óxido nítrico não provocou
alteração na permeabilidade microvascular.
A inibição da produção de NO provocou redução
nos níveis de GMPc celular, interrompendo a defosforila
ção dependente de GMPc da cadeia de miosina.
Este evento causou contração das células endoteliais e
um aumento no tamanho das junções celulares interendoteliais
levando a aumento na permeabilidade microvascular.
Além disso, o NO pode ser um importante varredor
fisiológico e/ou inativador do ânion superóxido, um
agente oxidante que pode ativar mastócitos. A inibição
do NO leva aumento no nível de antioxidantes e ativação
de mastócitos que se degranulam e aumentam a
permeabilidade vascular. A degranulação de mastócitos
pode ser inibida pela adição de doadores de NO.
Porém, segundo SALVEMINI e col. (1996), o
NO é um potente vasodilatador e seu envolvimento na
resposta inflamatória pode ter relação com sua habilidade
em aumentar a permeabilidade vascular e o edema
através de mudanças no fluxo sangüíneo local e do
aumento na produção de prostaglandinas pró-
inflamatórias.
ÓXIDO NÍTRICO E ISQUEMIA E
REPERFUSÃO
A isquemia-reperfusão é associada ao aumento no
número de leucócitos aderidos e emigrados, aumento
no extravasamento de albumina, formação de agregados
de plaquetas e leucócitos dentro de vênulas póscapilares
e degranulação dos mastócitos ao redor dos
microvasos mesentéricos. A redução dos níveis de NO
em tecidos após isquemia-reperfusão pode ser devida
à inativação da NOS e inativação do próprio NO pelo
superóxido que é produzido nesses tecidos. Segundo
ANDREWS e col. (1994), a diminuição do NO durante
reperfusão pode ocorrer ou pela destruição do NO pela
sua reação com radicais superóxido gerados na
reperfusão ou pela destruição das células endoteliais,
que são fonte de NO, por radicais livres derivados do
oxigênio gerados na reperfusão.
A disfunção endotelial caracteriza-se por uma
redução marcada na liberação de NO após a reperfusão,
que é seguida por um aumento da aderência de leucó-
citos ao endotélio reperfundido, tornando-se significante
20 minutos após a reperfusão.
Dois potentes inibidores da aderência e ativação
são PGI2 e NO, que são potentes vasodilatadores, mas
também inibem aderência de leucócitos e agem sinergicamente
para inibir a interação entre plaqueta e vaso. A
atividade dessas substâncias é bastante reduzida durante
a reperfusão, onde a disfunção endotelial é manifestada
pela perda da vasodilatação dependente de NO.
O NO apresenta efeitos vasodilatadores benéficos
no sistema microvascular, mas paradoxalmente pode
estar envolvido na produção de radicais citotóxicos. O
NO pode reagir com superóxido e produzir o ânion
peroxinitrito e dióxido de nitrogênio, que podem iniciar
a peroxidação lipídica e potencializar a lesão inflamatória
em células vasculares.
O aumento no nível de superóxido causa adesão
leucocitária, que pode ser prevenida pela adição de óxido
nítrico. O NO age como barreira fisiológica (varre ou
inativa) para ânions superóxido citotóxicos produzidos
continuamente por todas as células. O NO e o super-
óxido parecem regular a aderência de leucócitos ao endot
élio; parecem regular também a ativação e degranula
ção de mastócitos, eventos que promovem adesão
leucocitária. Doadores de NO bloqueiam a liberação de
PAF e de histamina de mastócitos ativados, enquanto o
superóxido promove degranulação de mastócitos
quando a síntese de NO é abolida.
A isquemia-reperfusão do intestino delgado é
caracterizada por aumento da permeabilidade microvascular
e disfunção da barreira mucosa. Neutrófilos e
superóxido derivado dos neutrófilos são os primeiros
mediadores da disfunção mucosa e microvascular que
ocorre após a isquemia e reperfusão. A liberação de
NO ocorre em várias regiões do intestino, como endoté-
lio vascular, células da musculatura lisa, nervos entéricos
(NANC) e células epiteliais. Talvez o NO contribua
como uma molécula protetória e antiinflamatória em
todas as camadas da parede intestinal. Pode-se
observar redução na produção de NO após reperfusão
em intestino delgado de gatos. A administração de
NO mostrou efeito protetório em lesões decorrentes
de isquemia e reperfusão mesentérica.
Em isquemia cerebral, o NO pode mostrar efeitos
benéficos ou neurotóxicos, quando em concentrações
excessivas.
Em isquemia e reperfusão do miocárdio, o NO
apresentou efeitos cardioprotetórios e atenuou a disfun-
ção endotelial61 e, segundo SIEGFRIED e col. (1992),
doadores de NO reduziram em um terço a área necrótica
após isquemia e reperfusão do miocárdio, em compara-
ção ao grupo controle.
MENSURAÇÃO DO ÓXIDO NÍTRICO
A mensuração do NO é essencial para o entendimento
da função do NO em diversos processos bioló-
gicos. A medida do NO em espécies biológicas é difícil
pela sua pequena quantidade e pela sua labilidade na
presença de oxigênio.
A presença de NO em sistemas biológicos é freq
üentemente determinada com base no efeito fisioló-
gico, como relaxamento dos vasos sangüíneos, ativação
da guanilil ciclase, aumento na concentração de cGMP,
produção de citrulina ou inibição da agregação plaquet
ária. Também pode ser avaliada usando-se
inibidores da síntese de NO, como análogos da Larginina
ou hemoglobina. Todos esses métodos têm
diferentes graus de especificidade e fornecem informa-
ções indiretas sobre a produção de NO. Apenas a cGMP
ou a concentração de citrulina podem ser usadas para
obter informações quantitativas relacionadas com a
quantidade de produção de NO.
A produção de NO também pode ser determinada
pela mensuração de isótopos estáveis no plasma ou
excretados na urina após administração de arginina
marcada.
A mensuração direta do óxido nítrico in vivo foi
realizada por HUK e col. (1997), que mediram a
liberação do NO em microvasos da musculatura
esquelética de coelhos, durante isquemia e reperfusão.
Microsensores foram usados para medir o NO liberado
em vasos sangüíneos de voluntários sadios e a
concentração de NO cerebral após isquemia e
reperfusão em ratos.
Embora o óxido nítrico seja objeto de muitas
pesquisas e de um grande número de publicações, ainda
existem muitas questões controversas e numerosas
dúvidas que precisam ser esclarecidas.
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